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【摘要】 目的 研究人脑星形细胞瘤中FHIT、PCNA蛋白的差异表达，探讨它们之间、它们与病理分级及复发之间的关系。方法 应用免疫组化SP法检测了50例星形细胞瘤中不同级别的FHIT、PCNA蛋白的表达水平，以10例非肿瘤脑组织作对照。结果 非肿瘤脑组织FHIT、PCNA蛋白阳性表达率分别为100%、0，星形细胞瘤中FHIT、PCNA蛋白阳性表达率分别为40%、86%；尽管在星形细胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表达总体差异有显著性（P<0.05），Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅳ级间比较差异有显著性（P<0.05），但Ⅲ级与Ⅳ级比较差异无显著性（P>0.05）；经统计学分析FHIT、PCNA蛋白呈显著负相关（P<0.01）；8例复发病例中复发前后FHIT、PCNA蛋白表达差异有显著性（P<0.05）。结论 星形细胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表达之间的显著负相关，提示FHIT蛋白可能对细胞增殖具有负性调控作用。FHIT、PCNA蛋白的表达水平可能与星形细胞瘤的病理分级和复发有关，推测FHIT、PCNA蛋白的表达可能与星形细胞瘤的肿瘤侵袭性相关。
【关键词】 星形细胞瘤; FHIT蛋白; PCNA蛋白
Expression and significance of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma
XI Zheng,XI Huan-jiu, GAO Zhi-an, et al. Medical examination center of ministry of healty,Beijing 100044, China
【Abstract】 Objective To study the expression of FHIT and PCNA proteins in human brain astrocytoma; To investigate the relationship between the expression of FHIT and PCNA proteins and pathological grading and recurrence in astrocytoma. Methods Immunohistochemistry staining for FHIT and PCNA proteins were performed in 50 cases of astrocytoma and 10 cases of non-tumor brain tissues. Results The total positive rate of FHIT and PCNA proteins were 100% and 0 in non-tumor brain tissues; and 40% and 86% in astrocytoma respectively; Though total variance of FHIT and PCNA proteins expression among tumor grades wasremarkable (P<0.05) , the significant differencesstatistically of FHIT and PCNA proteins were observed in gradeⅡ-grade,Ⅲ;and gradeⅡ-grade,Ⅳ(P<0.05),except those in grade Ⅲ-grade, Ⅳ(P>0.05); The expression of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma were significantly negative correlated(P<0.01), the significant differences statistically of FHIT and PCNA proteins were observed in 8 cases of recurrence (P<0.05). Conclusion In astrocytoma. there are significantly inverse relations between the expression of FHIT and PCNA proteins. It is suggested that FHIT protein may play a role in the negative regulation of cell proliferation. The expression of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma were significantly correlated with pathological grading and relapse likely. Abnormal expression of FHIT and PCNA proteins in astrocytoma may relate to tumor invasive.
【Key words】 astrocytoma；FHIT protein；PCNA protein
1996年Ohta［1］等人利用外显子捕获法（exon trapping）确定并克隆出FHIT基因。该基因定位在3号染色体短臂3p14.2区域，跨越人类染色体脆性部位FRA3B，并含有编码组氨酸三联体的功能区，故命名为脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad, FHIT）。FHIT基因存在于大多数正常组织中，许多恶性肿瘤存在该基因异常。研究FHIT 基因在各种肿瘤组织中的改变，确认其是否为抑癌基因是近年来分子肿瘤学研究的热点之一。Ji等［2］发现用FHIT的腺病毒转导的肺癌细胞系有很明显的细胞生长抑制和细胞凋亡的增加。同时，FHIT蛋白表达增加与细胞增生减少和凋亡活动增加相一致［3］。但此基因在肿瘤细胞增殖中的作用，目前国内外相关文献报道十分有限。本文研究FHIT、PCNA蛋白表达之间的关系，以及它们与星形细胞瘤各种病理级别和复发的关系，旨在探讨星形细胞瘤的FHIT蛋白的表达程度与肿瘤细胞过度增殖之间及复发的关系，为进一步了解星形细胞瘤的生物学特性，判断肿瘤的恶性程度和评估患者预后复发提供参考指标和实验依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
北京市神经外科研究所1998～1999年6月期间收治的随访资料完整的50例星形细胞瘤患者。Ⅱ级9例，Ⅲ级18例，Ⅳ级23例。经手术病理证实,术前均未采取放疗、化疗和免疫治疗。10例非肿瘤脑组织作为对照。标本经常规处理后5μm厚度连续切片，行HE染色和免疫组化染色。
1.2 主要试剂及仪器
兔抗人多克隆抗体FHIT（工作液），鼠抗人单克隆抗体PCNA（PC10，工作液），SP试剂盒等均购自北京中山生物技术有限公司。其他为免疫组化常用和必备的试剂和主要仪器。
1.3 实验方法
常规免疫组化染色过程。细胞浆出现棕黄色颗粒为FHIT蛋白表达阳性。参照Greenspan等的半定量法对染色强度及阳性细胞百分率进行评分，评分为1～3分判为低表达（减弱或缺失），≥4分判为表达正常［4］。细胞核出现棕黄色颗粒为PCNA蛋白表达阳性（反应性星形细胞、血管周围淋巴细胞、血管内皮细胞不列入计数），用3个参数的半定量法对染色强度及阳性细胞百分率进行评分，评分＜3分为阴性，≥3分为阳性［5］。
1.4 数据处理
采用SPSS统计软件。计数资料应用χ2检验、Fisher精确概率法、计量资料比较用LSD方差分析，相关用等级相关(Kendall和Spearman) 检验。
2 结果
2.1 FHIT、PCNA蛋白表达与组别的关系
如图1～3所示随着星形细胞瘤的病理级别升高，FHIT蛋白的阳性表达率降低, PCNA蛋白的阳性表达率增高。各级别星形细胞瘤FHIT、PCNA蛋白表达与对照组比较具有统计学意义（P<0.05），Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅳ级间具有统计学意义（P<0.05），而Ⅲ级与Ⅳ级间无统计学意义（P>0.05）。
2.2 FHIT蛋白表达与PCNA蛋白表达的关系
FHIT蛋白表达阳性的20例中有15例同时有PCNA蛋白的高表达，而FHIT蛋白表达阴性的30例中，PCNA蛋白表达阴性的有2例,经统计学分析
（Crosstabulation Correlations）两者呈显著相关性（P<0.01）， r=－0.493(Kendall检验)，r=－0.563(Spearman检验)，即呈显著负相关。提示FHIT蛋白可能具有对细胞增殖的负性调控作用。
2.3 星形细胞瘤中FHIT、 PCNA蛋白表达与复发的关系
8例复发星形细胞瘤中复发前后FHIT、 PCNA蛋白表达情况见表1。 而未复发的42例中FHIT蛋白阴性表达为15例， PCNA蛋白阳性表达为39例， 结果提示复发后FHIT蛋白阳性表达率降低、 PCNA蛋白阳性表达率增高， 经统计学分析P<0.05， 推测FHIT、 PCNA蛋白的表达与复发有关。表1 星形细胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表达与复发的关系（略）
3 讨论
星形细胞瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，它的病理分级是以肿瘤组织内从高分化到低分化过程的不同阶段人为划分，并以不同级别来估计临床经过及预后。但是，单以形态学为依据的分级标准不够准确、客观，某些交界性的病例难以确切分级；且由于肿瘤本身的异质性，取材部位的不同可能导致诊断上的误差。病理学分级诊断不能完全反映肿瘤的恶性程度，而肿瘤细胞增殖活性则能反映肿瘤的生物学特性及预后［6］。
Ohta等［1］首次发现一种新的肿瘤抑制基因，即FHIT基因，它在肿瘤发生发展中起重要作用。FHIT基因全长1.1Mb，包含FRA3B脆性位点［7］，编码分子量为16.8KD的蛋白质，即FHIT蛋白。FHIT基因通过其编码的蛋白质产物参与细胞周期的调节［8］。FHIT蛋白在肿瘤中的作用尚不完全清楚，可能因其蛋白质水解酶活性丧失将导致Ap3A或类似物在体内积累，刺激DNA聚合酶合成DNA，使细胞通过细胞周期G1期检测点进入S期，从而促进细胞增殖而启动细胞的恶性转化过程。同时，Ap3A水平升高增强了生长信号传导途径，阻断抑制途径或凋亡通道导致肿瘤产生。本文实验结果显示随着星形细胞瘤恶性程度的增加，FHIT蛋白的阳性表达率降低。经统计学处理星形细胞瘤Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅳ级间差异有统计学意义，提示星形细胞瘤中可能存在FHIT基因异常或基因表达异常，其异常表达可能与星形细胞瘤的发生发展有关。
细胞的增殖失控是恶性肿瘤的重要特征之一［9］。PCNA是真核细胞DNA合成必不可少的一种36kDa核蛋白，PCNA的表达和合成与细胞的增殖周期相关。新近研究证实它是DNA聚合酶的辅助蛋白，参与细胞增殖过程中DNA的合成，它在G1期开始增加，S期含量最高，G2期开始下降，M期含量最低。对DNA复制的调节起着重要作用，其含量和表达程度反映了细胞的增殖状态，其过度表达导致细胞增殖失控，是肿瘤恶性程度的重要指标［10］。实验结果显示随着星形细胞瘤恶性程度的增加，PCNA蛋白的阳性表达率升高。提示细胞在受到各种致癌因素作用后PCNA出现过表达，DNA的合成量增加，细胞增殖活性增高，最终导致癌变，与有关文献报道相似［11］。经统计学处理星形细胞瘤Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅳ级间差异有统计学意义，表明星形细胞瘤中恶性程度越高，肿瘤细胞的增殖活性越高。提示了PCNA蛋白可能与星形细胞瘤的发生发展密切相关。
星形细胞瘤的Ⅲ级和Ⅳ级是肿瘤恶性发展进程中的不同阶段，难以截然分开，可能正是这个原因使得这两种蛋白在Ⅲ级与Ⅳ级之间差异皆无统计学意义。
统计学分析认为FHIT蛋白与PCNA蛋白表达呈显著负相关（P<0.01），这与Morikawa［12］等报道一致。提示恶性程度高的星形细胞瘤有较高的细胞增殖率，可能与FHIT蛋白缺失有关。许多学者用酵母双杂交法筛选到与FHIT蛋白相互作用的蛋白，它的序列与人泛素结合酶9完全相同，已知酵母的泛素结合酶9与S期及M期细胞周期蛋白的降解有关，因此推测FHIT蛋白可能通过泛素结合酶来调控细胞周期。同时检测点异常可能导致受损伤的DNA顺利进入S期，而不能得以修复，从而促使细胞转化或增殖失控或凋亡受阻。因此提示FHIT蛋白可能具有对细胞增殖的负性调控作用。FHIT基因缺失或突变可能导致FHIT蛋白表达降低或丧失，从而导致细胞的恶性增殖。
在临床实践中，我们常常发现同一病理级别的星形细胞瘤患者其预后可能不同，从病理组织学角度有时难以解释。Beppu对20例低级别星形细胞瘤PCNA免疫组化染色的结果，经多变量分析统计处理显示PCNA是一个独立的预后判断指标［13］，与谭平国［5］等的报道一致。本试验8例复发病例中复发前后FHIT蛋白阳性表达率降低，PCNA蛋白阳性表达率升高。经Fisher精确检验（P<0.05单侧），提示FHIT蛋白和PCNA蛋白的表达水平可能与复发有关，因而这两种蛋白表达水平有可能作为判断复发的参考指标。
因此，联合检测FHIT蛋白和PCNA蛋白的表达，对了解星形细胞瘤的生物学行为及判断预后复发有重要的临床参考价值。
随着研究的逐步深入，会对FHIT基因与肿瘤的关系有更清晰的认识，为肿瘤的分子生物学研究提供新的思路，为开展肿瘤的基因治疗提供依据。当然，FHIT蛋白对细胞增殖的负性调控原理及FHIT基因的抑癌机制等问题还存在不少争议，将是今后研究的方向和重点。
【参考文献】
1 Ohta M, Inoue H, Cotticelli MG, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t (3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancer. Cell, 1996,84:587-597.
2 Ji L, Fang B, Yen N, et al. Induction of apoptosis and inhibition of tumorigenicity and tumor growth by adenovirus vector-mediated fragile histidine triad (FHIT) gene overexpression. Cancer Res, 1999, 59:3333.
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12 Morikawa H, Nakagana Y, Niki M, et al. Frequent expression of fragile histidine triad protein in human colorectal adenomas. Biochem Bio Phys Res Commun, 2000, 278:205-210.
13 Beppu T,Arai H,Kanaya H,et al.Measurement of PCNA labeling index in astrocytic tumors.No-sh-indei-Geks,1992,20(12):1255.
作者单位：1 100044 北京，卫生部国家医学考试中心2 121000 辽宁锦州，辽宁医学院3 北京，北京市神经外科研究所