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【摘要】 目的 探讨ERK1/2、p38-MAPK、PI3K/AKT等信号途径在HGF介导的肝干细胞增殖信号中的作用及其信号转导途径之间的相互联系和作用机制。方法 通过western blotting 检测ERK、 p38MAPK、Akt 信号分子及磷酸化蛋白的表达；通过3H-TdR掺入DNA的方法来检测细胞的增殖细胞。结果 在WB细胞，HGF确实能够激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/AKT途径。ERK途径在HGF刺激 5min后发生磷酸化，并且完全磷酸化发生在HGF作用15min，1h后逐渐消失。 Akt 也在HGF作用5min后发生磷酸化，15min后达到完全磷酸化并且持续至少2h。 P38 MAPK 途径也在 5min后开始激活，在 30min后逐渐减少，持续大约3h；我们还发现， 用MAPK抑制剂 U0126, SB23580 处理后能够明显减低HGF诱导的增殖效应, 但是用Ly294002处理阻断PI3K/AKT途径后则并不影响HGF诱导的增殖效应。表明，ERK1/2、p38MAPK 途径的激活参与HGF介导的细胞增殖效应，而PI3K/AKT途径则并不参与HGF介导的细胞增殖调控。结论 在WB细胞，HGF能够激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt等信号途径。ERK1/2 和 p38MAPK 途径的激活参与HGF介导的细胞增殖效应，而PI3K/AKT途径则并不参与HGF介导的细胞增殖调控。
【关键词】 肝干细胞； 细胞因子； 信号转导
Role of MAPK pathways in stem hepatocyte control and regulation for its, proliferation effect
YAO Peng，HU Da-rong.Institute of Liver Disease, PLA 100700,China
【Abstract】 Objective To study the role of MAPK and PI3K pathways in hepatocyte growth factor-mediated proliferation effect on WB F-344 cell. Methods To determine effect of HGF on ERK, P38 MAPK, and AKT phosphorylation. Cells were treated or not treated with the specific inhibitors before HGF (40 ng/ml) stimulation, than the phosphorylation of ERK, p38MAPK, Akt following HGF stimulation were analyzed by Western blotting; To determine which pathway involved in HGF induced proliferation activity, proliferation activity were analyzed by ［3H］ thymidine incorporation. Results The ERK, p38MAPK, Akt pathways were activated by HGF, and involved in mediating cellular proliferation. The proliferation effects of HGF were inhibited when MAPK pathway was abolished by the specific inhibitor U0126, but not inhibited when PI3K/AKT pathway was abolished by inhibitor Ly294002. It suggest that ERK, p38MAPK pathways are involved in HGF-induced proliferation in WB cells. But PI3K/AKT pathways are not involved in HGF-induced proliferation. Conclusion HGF activated ERK, P38 MAPK, and PI3K/AKT pathways; ERK, p38MAPK pathways are involved in HGF-induced proliferation in WB cells. But PI3K/AKT pathways are not involved in HGF-induced proliferation.
【Key words】 hepatic stem cells; cell factor;signal conduction
MAPK是一族胞浆内广泛分布的蛋白激酶，包括细胞外调节蛋白激酶(Extracellular-signal Regulated Kinase, ERK)、P38-MAPK、c-JUN N端激酶(JNK)。在细胞的增殖、分化和生存中起着重要作用［1，2］ ，多种增殖和抗凋亡信号通过MAPK的激活进行调控。它们参与细胞对各种信号的调节，触发级联性活化，在不同的时间将信号传导至不同的区域，产生如增殖、分化或凋亡等多种生物效应。
HGF是一种具有多种生物功能的细胞生存调节因子，能够介导细胞的增殖、离散及抗凋亡作用［1，2］。HGF的信号转导是通过其受体C-met的酪氨酸磷酸化而激发,HGF作用于c-met的β-亚单位C末端多功能位点，导致C-met和一些胞浆信号蛋白的相互作用，依次激活MAPK和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等信号途径［3，4］。在大鼠肝干细胞系WB F344细胞，HGF能够诱导明显的细胞增殖，然而HGF/met介导的信号系统在肝干细胞的传导机制还不十分清楚。
HGF诱导的肝干细胞的增殖作用是否也通过MAPK途径？这些信号途径如何参与肝干细胞的增殖调控？为此，我们的研究将探讨MAPK信号途径在HGF介导的信号转导中的调控。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 肝细胞生长因子Hepatocytes Growth Factor(HGF), 购自 Sigma. 不同信号途径的特异抑制剂均购自Promega 溶于 DMSO。 ERK 特异抑制剂U0126、 PI3K特异抑制剂Ly294002、 所用浓度均为 20μM。 p38 MAPK 特异抑制剂 SB 203580，所用浓度为15μM；ERK、p38MAPK，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体,ECL检测系统均为Santa Cruz 产品 。
DMEM为Gibco公司产品，胎牛血清为Life Technologies 公司产品，胰酶为Gibco公司产品， PMSF为Sigma公司产品, PVDF膜为Amersham公司产品。
1.2 主要仪器及设备 细胞培养箱：Heraeus；超净工作台：北京半导体设备一厂； 倒置显微镜：重庆光学仪器厂XDS-1；液闪仪:蛋白电泳仪及电转移装置：BIO-RAD 美国；成像仪：Stratagen Eagleeye II： 美国；可见/紫外分光光度仪：Beckman；PM-30自动照相系统：Olympus； Kodak Scientific Imaging Systems 软件分析系统。
1.3 细胞培养 大鼠WB-F344肝干细胞系，我所提供。
1.4 3H-TdR掺入DNA的方法来检测细胞的增殖细胞 细胞用胰酶消化，稀释细胞密度至50000细胞/ml，按每孔100μl接种于96孔细胞培养板，37℃5%CO2下培养24h,在含0.5%血清的培养液中饥饿24h, WB细胞用或不用各种特异的抑制剂(U0126 20 M;SB203580 15μM; Ly294002 20μM)预处理，然后加入HGF（40ng/ml）刺激24h, 每孔加入1.85×104Bq3H-TdR, 3h后收集细胞,以液闪计数表示刺激活性。
1.5 Western Blotting
1.5.1 细胞蛋白提取 WB细胞在含0.5%血清的培养液中饥饿12h，然后用HGF(40ng/ml)刺激不同时间（0、5、15、30、60、120min），收集细胞，用冰冷的PBS洗细胞3次,加入600μl RIPA裂解液(2×106 细胞), 置于冰上作用３０min, 用细胞刮取器刮下细胞, 4℃离心15000g离心，30min,上清即为总的细胞蛋白溶解成分。
1.5.2 比色法测定蛋白质浓度 分别在5ml离心管中加入0.2mg/ml牛血清白蛋白0、 50、 100、 200、 300、 400、 500, 以去离子水补足至500μl, 各管加入5ml考马斯亮蓝染色液,振荡混匀,测定A595, 取A595吸光值对标准蛋白浓度作图;测定待测样品的A595,从BSA标准曲线中确定其蛋白浓度。30μg 蛋白等量上样。
1.5.3 蛋白印迹 按常规方法进行SDS-PAGE，分离胶为10%；100转膜（经甲醇处理的PVDF膜），封闭1h, 用TBS-T洗一次5min, 置于兔抗鼠一抗 (用封闭液1:2000稀释)中,摇床上缓慢摇动1h,简单地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min，置于辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗 (用封闭液1:5000稀释)中, 摇床上缓慢摇动1h,简单地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min。用ECL系统进行检测，将A液与B液等体积混合，配成发光剂，均匀地涂在PVDF膜上，1min后吸去发光剂，用保鲜膜将PVDF膜包裹，X线片压片，曝光20s~5min, 显影2min，定影5min。
2 结果
2.1 细胞因子对肝干细胞增殖的影响 我们用不同的细胞因子，以不同的浓度对WB细胞进行作用，24h后，用H3-TDR掺入法检测细胞因子对WB细胞体外生长的影响。发现，HGF对WB-F344细胞具有促进增殖作用，并具有剂量效应正相关（见图1）。注：纵坐标为H3-TDR掺入CPM值；横坐标为细胞因子剂量
2.2 HGF 刺激WB细胞信号转导途径的激活 ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt等信号途径可以被多种细胞生长因子激活, 参与介导细胞增殖、离散、抗凋亡及分化。在肝干细胞，HGF是否激活这些信号转导途径，从而参与细胞调控？为此我们将WB 细胞在含0.5%血清的培养液中饥饿 12h, 然后用 HGF (40ng/ml)刺激不同时间（0、5、15、30、60、120min），通过western blotting 检测 ERK、 p38MAPK、 Akt 信号分子及磷酸化ERK、 p38MAPK、 Akt(P-ERK,P-p38MAPK, P-Akt)。结果显示（见图2）, 在WB细胞，HGF确实能够激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt途径。ERK 途径在HGF刺激 5min后发生磷酸化，并且完全磷酸化发生在HGF作用15min，1h后逐渐消失。 Akt作为PI3K的下游靶蛋白是一种多功能调节因子，参与细胞生存和凋亡的调控。 Akt 也在HGF作用5min后发生磷酸化， 15min后达到完全磷酸化并且持续至少2h。 P38 MAPK 途径也在 5min后开始激活，在 30min后逐渐减少，持续大约 3h。
2.3 MAPK信号途径在肝干细胞增殖调控中的作用 为明确MAPK途径在HGF介导的WB F-344细胞增殖中的作用，我们用特异的抑制剂(U0126 20M;SB203580 15 M)预处理WB细胞，分别阻断不同的信号途径，再用HGF（40ng/ml）刺激，24h后用H3掺入法检测细胞的增殖效应，发现用U0126、 SB203580 处理后能够明显减低HGF诱导的增殖效应,表明， ERK1/2和p38MAPK 途径的激活参与HGF介导的细胞增殖效应（见图3）。
3 讨论
细胞对于外界刺激的反应是通过信号之间的相互作用和交流进行的。当不同的信号进入细胞，细胞必须对多种信号进行平衡调节，最终作出一种适当的反应，如增殖、分化、生存或凋亡。蛋白激酶系列是细胞信号转导的重要介质，外界信号刺激后，可以触发多种蛋白激酶的级联活化，与各种信号相适应，传递并能够放大信号，从而在不同的时间将信号传导至不同的区域，维持不同的时间，并且产生多种及适当的反应方式［5，6］。
MAPK是一族胞浆内广泛分布的含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶。哺乳动物的MAPK家族包括ERK、JNK、P38-MAPK,由它们构建了几条基本的MAPK信号转导途径:（1）Ras/ERK通路;（2）JNK/SAPK通路;（3）P38-MAPK通路。MAPK途径,是将细胞外刺激信号传递到细胞核,介导细胞产生反应的细胞信息传递的重要通路, MAPK介导细胞生长、分裂、凋亡以及细胞间功能等多种细胞生理过程［7］ 。在生长因子及环境应激的作用下，丝裂原激活蛋白激酶被激活后可以调节DNA的复制与基因的表达。
研究表明MAPK的激活可能对决定细胞的命运起重要作用，比如细胞的生存、分化和凋亡［8］。炎性因子TNFα及各种刺激诱导的JNK和（或）P38途径的早期短暂激活和晚期持续激活分别与细胞的生存、分化及凋亡相关。
在我们的研讨中发现，HGF可以激活ERK、 p38MAPK 途径, ERK 途径在HGF刺激 5min后活化， 在15min时发生完全磷酸化，1h后逐渐消失。P38 MAPK 途径也在 5min后发生磷酸化激活，在 30min达到高峰，持续大约 3h。 我们进一步用U0126,SB203580特异地阻断ERK及p38-MAPK途径，再观察HGF介导的增殖作用。发现，U0126,SB203580处理后能够明显减低HGF诱导的增殖效应,表明，ERK1/2 and p38MAPK 途径的激活参与了HGF介导的WB细胞的增殖调控。
总之，这些结果表明，在WBF-344细胞，HGF可以激活ERK、p38MAPK途径；ERK、p38MAPK途径参与HGF介导的WB 细胞在增殖调控；由于ERK、p38MAPK途径介导的信号转导过程直接调节细胞的多种生理生化功能［9,10］，因而，在体内信号网络中的作用十分复杂，与细胞内多条信号转导通路有着密切的联系，这些信号间的复杂关系及相互作用机制还需进一步研究。
【参考文献】
1 Bliska JB. Yersinia inhibits host signaling by acetylating MAPK kinases. ACS Chem Biol,2006,1(6):349-351.
2 Wang Z, Yang H, Tachado SD,et al. Phosphatase-mediated crosstalk control of ERK and p38 MAPK signaling in corneal epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006,47(12):5267-5275.
3 Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling to the adapter proteins. Oncogene, 2000,19:5582-5589.
4 Shaharabany M, Abramovitch R, Kushnir T, et al. In vivo molecular imaging of met tyrosine kinase growth factor rqceptor activity in normal organs and breast tumors. Cancer Res, 2001, 61:4873-4878.
5 Kong AN, Yu R, Chen C, et al. Signal transduction events elicited by natural products: role of MAPK and caspase pathways in homeostatic response and induction of apoptosis Arch Pharm Res, 2000,23(1):1-16.
6 Jo M, Stolz DB, Esplen JE,et al. Cross-talk between epidermal growth factor receptor c-Met signal pathways in transformed cells. J Biol Chem, 2000,275:8806-8811.
7 Park JG, Yuk Y, Rhim H,et al. Role of p38 MAPK in the regulation of apoptosis signaling induced by TNF-alpha in differentiated PC12 cells. J Biochem Mol Biol, 2002, 35(3):267-272.
8 Yang GH, Jarvis BB, Chung YJ, et al. Apoptosis induction by the satratoxins and other trichothecene mycotoxins: relationship to ERK, p38 MAPK, and SAPK/JNK activation. Toxicol Appl Pharmacol, 2000, 164(2):149-160.
9 Wan X, Yokoyama Y, Shinohara A,et al. PTEN augments staurosporine-induced apoptosis in PTEN-null Ishikawa cells by downregulating PI3K/Akt signaling pathway. Cell Death Differ,2002,9(4):414-420.
10 Leist MF， Gantner H， Naumann H，et al. Tumor necrosis factor-induced apoptosis during the poisoning of mice with hepatotoxins. Gastroenterology，1997，112: 923-934.
作者单位：100700 北京，北京军区总医院肝病研究所