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【摘要】 目的 建立生物素标记HCV抗原及质量检定方法，研制双抗原夹心检测HCV抗体试剂。方法 用长臂生物素标记修饰过的HCV抗原，采用Avidin亲和层析柱方法计算标记率，SDS－PAGE检测纯度，酶联免疫测定活性。结果 生物素化HCV抗原的标记率为99.15%，纯度96.02%,用于检测抗HCV国家参考品,符合标准要求。结论 生物素化HCV抗原可用于双抗原夹心抗-HCV检测。
【关键词】 生物素化；HCV抗原；标记率；纯度
Labeling rate of the biotinalize HCV antigen,extracted purity and the activity detection
WANG Guo-hua,SONG Xiao-guo,CHEN Kun,et al.
Research Room of Diagnosis and Vaccine,Military Medicine Institute,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To establish the biotin labeling HCV antigen and the method of quality arbitration, to establish the double antigen sandwich detection HCV antibody kit. Methods Long arm biotin labeling HCV antigen which is modified, to adopt the avidin affinity column method to compute sign rate. SDS-PAGE detection purity quotient, ELIA liveness. Results The sign rate of biotinylation HCV antigen is 99.15%, purity quotient is 96.02%, and it is used for detecting the national of anti-HCV panel, to comply with a standard of request. Conclusion Biotin labeling HCV antigen may used for double antigen sandwich anti-HCV detection.
【Key words】 biotin alization;HCV antigen;labeling rate;purity
目前检测丙型肝炎病毒抗体仍采用间接酶联免疫法，但存在一定的假阳性及漏检，而HIV和梅毒抗体的检测均采用双抗原夹心方法，主要由于标记HCV抗原的技术存在一定的困难，致使标记后的HCV抗原活性降低。难于建双抗原夹心检测抗-HCV。我们在HCV嵌合抗原的基础上，以不同方式融合上4个赖氨酸，作为标记长臂生物素连接臂，以链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（HRP），建立生物素化抗原-链霉亲和素双抗原夹心（ELISA）检测丙型肝炎病毒抗体工艺。本文就生物素化HCV抗原标记方法、标记率、提纯纯度及活性检定进行报告。
1 材料与方法
1．1 生物素化HCV抗原的制备 用修饰过的HCV抗原 (5’- NS4-C -NS3 --NS5-4KR 2mg/ml ） 溶于0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液，将4mg长臂生物素溶解在800μl的二甲基亚砜溶液中（临用时配制），然后取500μl长臂生物素溶液加入到抗原溶液中；抗原:生物素= 1:2，充分混匀；置冰上2h，然后室温放置30min。0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，以除去未标记的生物素；分装后-20℃保存备用。
1.2 标记抗原长臂生物素的标记率所需材料 (1)亲和层析柱：Softlink Soft Release Avidin Resin, Promega Catalog #V2011, System lot# 226425, size 1 ml。(2)紫外分光光度仪：Spectronic GeneSys 2。(3)缓冲液（按说明书配制）：0.1 M NaPO4, pH 7.0。(4)洗脱液（按说明书配制）：10% 冰醋酸。
1.3 方法 (1) 标记抗原用分光光度法定量（测定A280光吸收值）： 标记抗原用缓冲液稀释10倍后，测A280值 （TA）。(2) 亲和层析柱：装一层析柱，用缓冲液10ml 平衡，备用。(3) 上样与洗柱：取标记抗原0.5ml, 轻轻加在亲和柱表面，按说明书，慢慢进入柱体后，夹住流出口15min；用缓冲液洗涤，洗出液分2管: FA1, 2ml; FA2, 6ml(FA)。(4) 洗脱：分2步进行：①慢慢加入10%醋酸溶液3ml，并接洗脱液3ml (BA1) ；② 再加入10%醋酸溶液4ml后，再以4ml缓冲液洗，全量收集8ml (BA2)。(5) 测定各组分的A280 值。
1.4 提纯纯度 (1)SDS－PAGE：15％的分离胶，5％的积层胶，样品液与等量的2×加样缓冲液（0.1M Tris-HCl、4%SDS、20％甘油、0.2％溴酚兰、pH 6.8）混合，煮沸5min，上样5μg，电泳缓冲液为Tris－甘氨酸（pH 8.3），60mA电泳1h。(2) 染色及脱色：将电泳胶用考马斯蓝染色1h，脱色液(20%乙醇，10%乙酸) 脱色。(3) 用电泳胶数字化检测系统对电泳胶进行扫描，然后用Gel-ProR Analyzer Version 3.0 for WindowsTM 软件分析样品的纯度及分子量。
1.5 对各抗原活性影响资料分析 采用间接ELISA测定生物素标记抗原的活性：用生物素标记的HCV融合抗原包被酶联板，并与包被抗原，修饰后用于标记的抗原同时包被，对比测定三种抗原的免疫活性，分析丙肝抗原标记后其活性有否变化。分三组包被（1）试剂盒中包被所用丙肝抗原；（2）N端连接4KR用于标记的丙肝抗原；（3）生物素标记后的丙肝抗原。三组包被抗原与我们建立的10份阳性及阴性血清样品进行反应，观察标记抗原的免疫活性。
2 结果
2.1 生物素化抗原的标记率 通过利用市售固相化的Avidin亲和层析柱，可以和标记抗原中的长臂Biotin 呈高亲和力结合，而没标记上Biotin的游离抗原则不能和固相化的Avidin结合而直接从亲和层析柱逸出，根据逸出部分的多少（即未标记抗原FA），和上样总标记抗原量（TA）可以计算出标记率{R = （TA-FA）/TA}。此外也可以再从亲和柱上洗脱结合的标记抗原（BA）计算出其标记率{R = BA / TA}。
2.2 生物素化抗原的纯度检定 通过SDS－PAGE：15％的分离胶，5％的积层胶对生物素化抗原进行纯度检定，结果 Bio-HCV融合抗原纯度为96.02%,分子量为75.21KD（如图1所示）。
2．3 对各抗原活性影响资料分析 对我们建立的10份阳性及阴性血清样品进行反应，观察标记抗原的免疫活性，见表1。
图1 Bio标记-HCV融合抗原纯度及分子量 略
表1 ELISA方法同时检测三组抗原活性 略
2.4 生物素标记后抗原对活性的影响 我们采用双抗原夹心技术，观察对国家HCV参考品的反应性，是否达到国家标准品的要求，见表2、表3。
敏感性：根据国家标准品四个系列血清中L1、L2、L3应为阳性，L4应为阴性。
表2 国家标准品四个系列血清L1、L2、L3、L4检测结果
血清系列 L1 L2 L3 L4
检测值 0.657 0.487 0.310 0.044
表3 国家参考品30份阳性、30份阴性检测结果 （略）
3 讨论
我们目前抗原标记方法采用了市售已活化的长臂Biotin(EZ-Link, Sulfo-NHS-Biotin Reagent )进行标记抗原，而且在重组抗原的N-末端还连接上4个赖氨酸残基（提供和活化Biotin反应的游离氮基），在标记过程中又采用了相对过量的活化Biotin（按克分子计算约每个抗原分子100个biotin）, 因此在这样的条件下，理应每个抗原分子都可得到标记（即标记率100%）。根据我们用亲和层析法测定，所有标记物都可为亲和柱吸附住（淋出液中没有紫外吸收）。在柱体再生的洗脱液中总A280吸收值0.704，上样总标记抗原量A280吸收值0.710（即标记率为99.15%），这应在误差范围之内。通过SDS－PAGE 15％的分离胶，5％的积层胶对生物素化抗原进行纯度检定，结果 Bio-HCV融合抗原纯度为96.02%,分子量为75.21KD，可满足双抗原夹心检测丙型肝炎病毒抗体的要求。
采用国家第三代抗HCV参考品，以生物素-亲和素系统，采用双抗原夹心，对纯化的生物素标记抗原的免疫活性测，结果符合国家参考品的要求。
作者单位：100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所诊断与疫苗研究室（△通讯作者）