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【摘要】 目的 研究人破伤风疫苗免疫方法对供血浆者抗-TT效价的影响，筛查符合制备人破伤风免疫球蛋白标准的原料血浆的检测方法。方法 对符合规定的志愿供血浆者进行分组，以同一剂量不同免疫程序进行免疫。采用ELISA定量检测两组供血浆者抗-TT效价水平，将抗-TT效价≥80IU/ml的供血浆者列为采集特免血浆对象，并将其血浆样作小鼠试验进行效价的复检。结果 供血浆者组别间相同剂量疫苗不同免疫程序产生高效价抗-TT的比率比较差异明显；0、4周免疫程序组产生高效价的比率明显高于0、8周免疫程序组，而且前者抗-TT高效价持续时间较后者的长。经ELISA初筛检测达标的血样经小鼠中和试验法复查，两结果比较差异无显著性。结论 采用40IU吸附破伤风疫苗，0、4周程序免疫供血浆者可获得高效价抗-TT原料血浆，两种程序均可提高供血浆者的抗破伤风抗体水平，能够达到终身保护的浓度。同时还进一步证实了ELISA检测方法用于大规模筛查抗-TT高效价原料的可行性。
【关键词】 破伤风疫苗 供血浆者 抗-TT;ELISA法
Study on the human immunity with tetanus toxoid and the method for screening the high anti-TT titer plasma
ZHOU Hai-yun, HE Yan-lin,HU Jun, et al.Lanzhou lnstitute of Biological Products, Lan zhou 730046, China
【Abstract】 Objective Investigating the effect of immunized procedure of tetanus toxoid (TT) on the anti-TT titer of plasma donor and screening the test Methods Used for detecting Source plasma according with the demands of anti-TT IgG. The plasma donors were divided into two groups and then the subjects were immunized with tetanus toxoid with the different procedures (the same dosage). The anti-TT IgG titer of plasma donor was detected by ELISA kits. The plasma donor that the titer of anti-TT antibody is>80 IU/ml was regard as a special immunol plasma donor use for selecting plasma. Results Indicated that the ratio of the high titer of anti-TT antibody between two groups is of the distinct difference, the ratio of high titer of antibody in the group immunized according to 0 and 4 week is higher than that of other group(0 and 8 week procedure), and the anti-TT titer of the former’s sample can maintain for longer time. The results of retesting the samples which were in keeping with the standard using ELISA showed that have no difference between two groups. Conclusion The anti-TT IgG titer plasma donor in the group (0 and 4 week procedure)is higher,but both procedures can improve the level of anti-TT IgG of plasma donor,and ELISA is practicible for screening.
【Key words】 tetanus toxoid;plasma donor; anti-TT antibody; ELISA
破伤风是由产生毒素的破伤风杆菌引起的致死性传染病，其高毒力的痉挛毒素可阻断中枢神经系统的抑制性神经递质，引起肌肉强直和典型的全身痉挛，目前仍是全球众多地区的一个重要公共卫生问题，尤其是热带发展中国家最贫穷地区，母亲和新生儿破伤风的发病率和死亡率较高［1］。破伤风可通过免疫接种含破伤风类毒素（tetanus toxoid, TT）的疫苗来预防，破伤风疫苗与其他百日咳、白喉疫苗一起作为联合疫苗（DTP）早已纳入我国儿童计划免疫。然而，在国家免疫计划低覆盖率，尤其是计划免疫实施前出生的人群中会有破伤风的发生，许多育龄期妇女不能预防分娩相关的破伤风。另外，尽管已接受过基础免疫，为了获得持久的免疫力，还须加强免疫。除了注射疫苗外，人类防治破伤风主要是注射马血清破伤风毒素（tetanus antitoxin, TAT）和人破伤风免疫球蛋白（human tetanus immunglobulin, TIG），由于前者系马血清制品，常常引起过敏反应，为此，20世纪60年代欧美各国相继研制出TIG用于临床，并逐渐取代TAT［2］。TIG系由供血浆者经吸附破伤风疫苗免疫后采集抗-TT效价高的原料血浆制备。为了探讨供血浆者进行破伤风疫苗免疫的影响，建立筛查符合标准的抗-TT原料血浆方法，笔者采用相同剂量不同免疫程序分别免疫符合要求的供血浆者，并将ELISA检测方法筛查合格的血浆样品与小鼠试验法检测结果进行复检，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 吸附破伤风疫苗（0.5ml，含破伤风类毒素效价≥40IU，批号：20030701）由兰州生物制品研究所提供，ELISA定量检测破伤风抗体诊断试剂（批号：20060207，20060705，20060819，20070109）由珠海海泰生物药业有限公司提供，人破伤风免疫球蛋白标准品（10IU/ml，批号：001，中国药品生物制品检定所），抗-HCV、抗-HIV（Ⅰ＋Ⅱ）、HBsAg、梅毒等诊断试剂盒均由兰州生物制品研究所提供，ALT试剂（自配），PCS-2型全自动血浆采集机（美国血液技术公司），MK3酶标仪，洗板机（芬兰DENLEY公司）。
1.2 分组方法 将志愿供血浆者分成两组（A组，B组），每组按各自的疫苗剂量和不同的免疫程序进行免疫。对那些无应答或抗-TT效价≤8IU/ml的供血浆者实施一次强化免疫。
1.3 原料血浆采集 按《中华人民共和国药典》2005年版（三部）“血液制品原料血浆规程”要求采集。
1.4 检测方法 初筛采用ELISA定量测定法，按诊断试剂盒说明书进行操作，在0～160mIU/ml范围绘制标准曲线，同时做20mIU/ml和40mIU/ml标准品对照［3］。超出标准曲线范围的样品进行100倍 稀释，再次检测其结果时乘以100。复检按《中华人民共和国药典》2005年版（三部）附录XIF破伤风抗毒素效价测定法进行测定，并将其检测结果与ELISA法检测结果进行比较。
1.5 判定标准 检测结果至少达到0.1～0.2IU/ml（ELISA法评价）［1］的血样常被认为对供血浆者具有保护作用；≥80IU/ml的血样为高效价抗-TT原料血浆的供血浆者。
2 结果
2.1 相同剂量不同免疫程序免疫获得的供血浆进行抗-TT效价分布 见表1，从表1可以看出，两组间抗-TT效价分布百分比率有明显差异。表1 相同剂量（40IU），不同免疫程序免疫供血浆者抗体效价分布
2.2 供血浆者持续供血浆后抗-TT变化 见表2，由表2可以看出，A组供血浆者在进行第5次供血浆时抗-TT≥8IU/ml的人数比例下降至8.82%，到第8次时下降至1.47%；B组抗-TT≥8IU/ml的供血浆者较A组下降趋势更快，到第5次时下降为3.3%，第6次时已下降至零。表2 供血浆者持续献血浆后抗-TT的变化
2.3 破伤风疫苗免疫供血浆者效果的比较 见表3，从表3可以看出，经0、4周或0、8周免疫程序，40IU剂量免疫30天后，免疫效果比较明显（所有供血浆者在免前检测抗-TT效价达到≥0.1IU/ml保护效价的甚少，几乎为零），有98%以上的供血浆者具有预防破伤风的保护抗体。表3 TT免疫供血浆者效果比较
2.4 ELISA定量测定法与小鼠中和试验检测法结果比较 见表4，由表4可以看出，通过对血浆样品、混合浆样品和TIG半成品样品的检测，两种检测方法结果差异不明显，比差范围在80%～88%之间。表4 ELISA法与小鼠中和试验法 抗-TT效价测定结果比较 注：1～4为血浆单份样品；5为血浆混合样品；6为TIG样品
2.5 破伤风疫苗全程免疫供血浆者抗-TT效价趋势分析 见图1。从图1可以看出，A组（0、4周程序免疫）供血浆者随着采浆次数的增加，其血浆抗-TT效价下降呈平稳趋势；B组（0、8周程序免疫）供血浆者随着采浆次数的增加，其血浆抗-TT效价第3次采浆时已开始下降（≤8IU/ml），到第6次时已降至2.1IU/ml，此时不得不进行加强免疫，1个月后其血浆抗-TT效价开始上升（≥8IU/ml），到第9次采浆时升至10IU/ml以上。
3 讨论
志愿供血浆者经破伤风疫苗（40IU）基础免疫后，绝大部分血浆抗-TT转阳（约占98%以上），其中约15%～20%供血浆者的血浆抗-TT效价能达到8IU/ml以上，其余供血浆者经再次加强免疫后均可大大提高高效价血浆的比率，这一结果表明，无论从广大供血浆者自身免疫力提高，避免因感染破伤风患病的危险，还是大规模筛查采集高效价的破伤风原料血浆都具有非常重要的意义。
与此同时，绝大多数志愿供血浆者在完成全程免疫的过程中无严重的副反应发生，只有极少数供血浆者局部出现红肿，1～2天后自行消失；按40IU剂量疫苗，0、4周免疫程序免疫供血浆者达到高效价血浆的比率较高，对抗-TT≤8IU/ml的供血浆者适时进行强化免疫也能获得较好的效果，这一结果与有关文献报道的情况基本一致［4］，符合制备人破伤风免疫球蛋白的标准。
如WHO最近关于破伤风疫苗的意见书中指出的那样，“保护性抗体浓度”并不能保证在各种情况下都具有免疫力，目标应是终身维持高水平的抗体浓度［1］。为使体内的抗-TT水平达到上述要求的浓度，必须按规定的要求不间断地进行破伤风疫苗免疫；其二是为了采集更多的高效价原料血浆制备出安全有效的人破伤风免疫球蛋白（TIG）制品［5～7］，使其取之于民，用之于民，减少或降低因注射马血清制品（TAT）带来的过敏反应。
通过以上一些初步的研究，获得了适合的供血浆者破伤风疫苗剂量、免疫程序，建立了大规模筛查抗-TT高效价原料血浆的方法，也为今后制备人破伤风免疫球蛋白打下了良好的基础。
（致谢：承蒙宁夏区青铜峡单采血浆站同仁在宣传、组织供血浆者方面大力的协助和支持；本所血清室张金主任、李秋菊同志、王惠玲同志在破伤风抗毒素检测工作中鼎力帮助。再次一并致谢！）
【参考文献】
1 严有望，李少安.WHO关于破伤风疫苗的意见书.国际生物制品学杂志，2007，30（1）：12-14.
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4 杨明，葛少华，刘美佳,等.获得高效价人破伤风抗体原料血浆免疫方法的探讨.中国输血杂志，2005，18（3）：217-218.
5 赵淑良.人破伤风免疫球蛋白的研制.生物制品学杂志，1998，1（1）：38-39.
6 周海云，江丽君.人破伤风免疫球蛋白及其应用.微生物学免疫学进展，2006，34（2）：84-86.
7 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（2005年版，三部）.北京：化学工业出版社，2005，179.
作者单位：730046 甘肃兰州，兰州生物制品研究所血液制剂室