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【摘要】 目的 探讨β-catenin、P53和增殖细胞核抗原（PCNA）在结直肠腺瘤癌变中的可能作用。方法 以免疫组织化学方法检测77例结直肠腺瘤（CRA）及癌变组织中β-catenin、P53蛋白及PCNA的表达情况。结果 CRA随上皮异型增生程度的提高及癌变的出现，β-catenin异常表达逐渐增高（P<0.01）。伴中、重度上皮异型增生的CRA和CRA癌变组织中，β-catenin核表达阳性率明显高于上皮轻度异型增生的CRA（P<0.01）。CRA伴轻度异型增生和CRA伴中、重度异型增生及CRA癌变3组的P53蛋白和PCNA表达依次增高，其阳性率分别为10.3%、43.8%、75.0%和17.2%、62.5%、87.5%。在β-catenin核表达阳性者中，其PCNA的强阳性表达率明显高于β-catenin核表达阴性者（69.7%和36.4%，P<0.05）；在P53蛋白表达阳性者中，其PCNA的强阳性表达率明显高于P53表达阴性者（72.4%和37.5%，P<0.05）。在CRA癌变组中，有50%可见β-catenin和P53同时表达。结论 β-catenin、P53和PCNA在CRA癌变转化过程中可能发挥了重要作用。
【关键词】 结直肠肿瘤 P53蛋白 β-catenin 增殖细胞核抗原 免疫组织化学
Study of immunohistochemistry and celluler proliferation activity on carcinogenesis of colorectal adenoma with malignant transformation
ZHANG Pin-nan, LU He-lian ,WANG Zhong-quan,et al.Wenzhou Third Peple’s Hospital, Wenzhou Zhejiang 325000,China
【Abstract】 Objective Research was done on the possible roles of β-catenin , P53 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA ) in the carcinogenesis of colorectal adenoma (CRA). Methods β-catenin and P53 and PCNA expression were studied with immunohistochemical stain in 77 specimens of CRA together with mild epithelial dysplasia (CRA-MD) , CRA with moderate/severe epithelial dysplasia (CRA-D/SD) and CRA with cancerous changes(CRA-C).Results The percentage of abnomal expression of β-catenin increased during the transition from CRA-MD to CRA-D/SD to CRA-C(P<0.01).The nuclear expression of β-catenin in CRA-D/SD and CRA-C were all significantly higher than that in CRA-MD expression of P53 and PCNA were increased from CRA-MD to CRA-D/SD to CRA-C, with the positive rates in these three groups of 10.3%,43.8%,75.0% for P53 and 17.2%,62.5%,87.5% for PCNA ,respectively. 69.7% of cases with positive nuclear β-catenin expression showed strong PCNA positivity which was much higher than the 36.4% of cases without nuclear β-catenin expression (P<0.05).The percentage of strong PCNA expression in the P53 positive cases was significant higher than that in cases with negative P53 expression (72.4%vs37.5%,P<0.05). Nuclear β-catenin and p53 co-expression rates in CRA-C reached 50%.Conclusion β-catenin, P53 and PCNA may play important roles in the carcinogenesis of colorectal adenoma.
【Key words】 colorectal neoplasms ; P53 protein; β-catenin ;proliferating cell nuclear antigen; immunohistochemisty.
结直肠腺瘤（CAR）是一种具有癌变潜能的良性病变［1］。Zhang等［2］用流式细胞术，定量研究了CRA癌变过程中rasP21、P53表达情况，发现CRA 由上皮不典型增生到癌变过程中，rasP21和P53蛋白表达量均呈明显递增趋势。为进一步探讨CRA癌变机理，我们采用病理形态学与免疫组织化学相结合的方法，检测了77例管状、绒毛状CRA及其癌变组织中β-catenin、P53和PCNA表达情况。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集我院和乐清第三人民医院1995年1月～2007年1月间中、老年人结直腺瘤癌变的活检和手术标本77例，按照《全国大肠癌病理研究统一规范》［3］之标准进行腺瘤分类、异型增生分级和腺瘤癌变的诊断。77例结直肠腺瘤癌变病例中男42例，女35例，年龄45～88岁，平均58.9岁。病变发生在结肠32例，直肠45例。肿瘤直径< 1cm者37例，1～2cm者22例，>2cm者18例。病史在12个月内62例，12个月以上15例。管状腺瘤26例，绒毛状腺瘤24例，管状绒毛状腺瘤22例；所有腺瘤癌变标本均伴有轻、中、重度异型增生，本组将异型增生分为两类：重度（Ⅲ级）和轻度（Ⅰ级或Ⅱ级）异型增生。另选10例正常结直肠黏膜组织作为对照组。
1.2 方法 所有标本均经中性甲醛液固定，石蜡包埋后行4μm连续切片，除常规HE染色外均同时采用En vosion 法免疫组织化学染色标记，观察β-catenin、P53、PCNA的表达情况。所有单抗与多抗免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。实验步骤按试剂盒说明书进行，3种一抗稀释度均为1：100。采用En vosion法对全部病例及对照组正常黏膜进行免疫组化染色，染色前用微波炉进行抗原修复。以乳腺癌组织切片作阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定 （1）β-catenin阳性反应限于细胞膜，而胞浆和胞核无着色者视为阴性；若细胞核或细胞浆出现棕黄色着色则视为β-catenin阳性。（2）P53蛋白及PCNA均为细胞核表达，呈棕黄色颗粒状，无阳性反应细胞为（-）；阳性细胞数占1%～25%者为（+）；阳性细胞数占26.5%～50%者为（++）；阳性细胞占51%～75%为（+++）；阳性细胞>75%为强阳性。
1.4 统计学处理 将实验数据输入计算机，以POMS统计软件作统计学处理。
2 结果
2.1 β-catenin的表达 10例正常大肠黏膜均可见细胞膜呈棕黄色染色，但细胞核及细胞浆未见着色。29例CRA伴轻度不典型增生组中，11例细胞浆阳性，3例细胞核阳性，3例细胞浆及细胞核共同表达；32例CRA伴中、重度上皮不典型增生组织中，25例细胞浆阳性，20例细胞核阳性，15例细胞浆及细胞核共同表达；16例CRA癌变组中，细胞浆均为阳性表达，10例细胞浆及细胞核共同表达。在CRA及其癌变中，部分病例出现细胞浆和细胞核阳性着色，细胞浆和细胞核共同着色者，细胞膜着色减轻。CRA腺上皮从不典型增生到癌变过程中，β-catenin在细胞浆表达阳性率以及在细胞浆和细胞核共同表达的阳性率逐渐递增（χ2=14.73,P<0.01）。中、重度不典型增生组和CRA癌变组中β-catenin核表达阳性率均明显高于上皮轻度不典型增生组（χ2=20.08,P<0.01）。
2.2 P53的表达 10例正常大肠黏膜上皮细胞均未见P53阳性表达。16例CRA癌变组织中，有12例（75.0%）呈阳性表达，其中8例（50.0%）为强阳性表达（图1）；32例CRA伴中、重度异型增生的组织中，14例呈阳性表达，占43.8%，仅2例（6.3%）呈阳性表达；39例上皮轻度异型增生的CRA中，仅3例呈弱阳性表达，且仅限于极个别腺体，占10.3%。结果显示，CRA随上皮异型增生程度的加重到癌变的出现，P53表达明显递增（χ2=19.22,P<0.05）。
2.3 PCNA的表达 10例正常结直肠黏膜上皮出现弱阳性表达，阳性细胞位于黏膜腺体基底部，表面分化成熟上皮无阳性表达。随CRA上皮异型增生程度的递增直至癌变，PCNA表达强度也随着明显递增(图2)（χ2=23.44,P<0.01）。
2.4 β-catenin表达与P53和PCNA表达的关系 CRA伴轻度异型增生组未见β-catenin和P53同时表达，而CRA伴中重度异型增生组二者同时表达者占28.1%（9/32），CRA癌变组则达到50.0%（8/16；χ2=16.15,P<0.05）。在β-catenin核表达阳性组织中，有69.7%PCNA呈强阳性表达（图2），明显高于β-catenin表达阴性者（χ2=8.60,P<0.05）,提示β-catenin在细胞核的积聚中多出现在一些增殖活性高的细胞。在P53蛋白表达阳性者中，PCNA均为阳性表达，而且其强阳性者明显高于P53蛋白阴性者（χ2=23.44,P<0.05）。此外，β-catenin、P53蛋白及PCNA表达与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、大小以及病史无关。
3 讨论
β-catenin作为细胞间粘连的重要组成成分，在正常细胞质游离水平较低。它的主要作用adherin,形成E-cadherin-β-catenin功能复合体，调节细胞粘附系统，影响细胞粘附性、运动性，进而影响组织结构和形态变化。同时，β-catenin也参与细胞信号传导途径［4］。CRA基因（APC）是肿瘤抑癌基因，它的突变是大肠腺瘤→腺癌序列中较为普遍的基因差异，常发生在癌变早期阶段［5］。最近研究发现，细胞内β-catenin水平受APC蛋白调节，APC上基因突变可导致β-catenin聚集并异位于核上，β-catenin分布的检测可作为评价大肠肿瘤早期发展阶段临床-病理特征潜在恶性的标准［6］。除APC基因突变，β-catenin基因本身突变也可以导致β-catenin聚集。有学者认为，β-catenin基因突变可能是大肠肿瘤形成的早期事件［7］。本研究结果显示，CRA随腺上皮异型增生程度的加重和癌变的出现，β-catenin细胞质阳性表达率和细胞质、细胞核同时表达的比率依次升高，而细胞核的阳性率在CRA中、重度异型增生和癌变两组间未见明显差异。提示在CRA癌变过程中，首先出现β-catenin在细胞质的异位积聚，而后才出现在细胞核的异位积聚。β-catenin异位积聚在CRA癌变过程中发挥着重要作用，其在细胞核和细胞质的异位聚集可能反映了CRA癌变过程中APC突变或β-catenin基因的突变。
抑癌基因P53失活表现为突变型P53蛋白的过度表达。本研究发现，CRA由上皮轻度异型增生→中、重度异型增生→癌变，P53蛋白表达阳性率也随着递增，分别为10.3%、43.8%和75.0%，表明P53蛋白过度表达与CRA恶性倾向密切相关，提示P53的突变在CRA癌变过程中可能发挥了一定作用。Damalas等［8］研究了在大肠癌形成过程中β-catenin过度表达对P53的影响，发现β-catenin过度表达通过干扰P53降解而导致其聚集。但也有学者提出了不同观点，认为β-catenin与P53在大肠肿瘤中表达无明显相关性。本研究结果显示，虽然CRA伴轻度异型增生组部分病例可见β-catenin异位核表达或P53蛋白的表达，但未见二者同时呈阳性的情况，而CRA伴中、重度异型增生组二者同时表达者28.1%，CRA癌变组则达到50.0%。表明β-catenin和P53共同表达在CRA癌变中可能发挥着重要作用。PCNA是真核细胞DNA聚合酶8的辅助蛋白，在DNA复制中起重要作用。一般认为，旺盛的增殖是细胞癌变的基础。本研究结果显示，随着CRA上皮异型增生程度加重和癌变，细胞核PCNA强阳性表达率同步递增，表明CRA癌变过程中细胞增殖活性逐渐提高。同时还发现，PCNA的强阳性表达与P53蛋白表达及β-catenin细胞核异位积聚平行。以上结果表明，β-catenin核异位、P53基因突变及PCNA强阳性表达在CRA癌变中可能发挥了重要作用。
(本文图片见封三）
【参考文献】
1 王慧萍，姚洪田，丁伟，等.结直肠腺瘤及癌变组织中增殖基因和细胞凋亡基因的表达.中华病理学杂志，2000，29（6）：405-408.
2 Zhang XH, Wu WX, Lu HT, et al . celluar DNA, ras P21and P53 expression in the carcinogenesis of colorectal adenomatous ployps . Analyt Quant Cytol Histol,1999,21(3):449-453.
3 史景泉，陈意生.现代外科病理学.北京：人民军医出版社，1998,155-157.
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6 Shimizu M, Yoshimi N ,Shimizu S ,et al .The relationship between the histopathological atypia and expression of β-catenin in colonic neoplasms resected by endoscopy; comparison with that of P53 protein Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi, 1999,96:1050-1056.
7 Samwitz WS, Powers MD, Spirio LN， et al . β-catenin mutations are more frequent in small colorectal adenomas than in larger adenomas and invasive carcinomas. Cancer Res, 1999,59:1442-1444.
8 Damalas A, Benzeev A , Simcha I, et al .Excess β-catenin Promotes accumulation of transcriptionally active P53. EMBO J ,1999 ,18:3054-3063.
作者单位：325000 浙江温州，温州市第三人民医院