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【摘要】 目的 构建肝癌多表位基因和含Tat PTD的多表位基因的原核表达载体，表达纯化融合蛋白，比较其细胞免疫反应。方法 人工合成多表位和Tat基因；分别克隆入原核表达载体pBVIL1，构建含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因原核表达载体pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T；诱导表达、纯化目的蛋白；IFNγ- ELISPOT法检测免疫小鼠的细胞免疫应答。结果 正确构建复合表位基因的原核表达质粒，目的蛋白质在大肠杆菌中获到高效表达，并得到有效纯化；ELISPOT检测显示Tat+T蛋白免疫组能更有效地激发特异性T细胞免疫反应。结论 所构建的含Tat PTD的新型复合表位抗原能激活特异性CTL反应，为基于CTL表位的肝癌免疫治疗提供了实验依据。
【关键词】 肝细胞癌 T细胞表位 ELISPOT Tat PTD
Detecting the cell immune response of recombinant multiple epitopes antigen of hepatocellular carcinoma by IFNγ - ELISPOT
HE Jing, ZHANG He-qiu, WANG Guo-hua, et al.Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
【Abstract】 Objective To construct the prokaryotic recombinant plasmid to express HCC multiple epitopes gene, then purify the fused protein for ELISPOT analysis.Methods The gene of multi-epitope were gained and it was cloned into prokaryotic expression vector and expressed in E.coli. An recombinant eukaryotic expression vector was constructed and its eukaryotic expression was determined in transfected cells. Balb/c mice were immunized with different forms of antigen. The cell immune response was tested by ELISPOT.Results The recombinant prokaryotic plasmid was correctly constructed. The gene was expressed in E. coli. highly and the expressed protein was purified efficiently. The antigen specific T cell response IFN-γ release was much stronger in protein Tat+T group than in the other groups.Conclusion This preliminary result showed that immunization with those improved recombinant polyepitope antigen has high antigenicity, especially in induction of high CTL response. This research may be useful to further development of immunotherapy for HCC.
【Key words】 hepatocellular carcinoma;T-cell epitopes;ELISPOT;TatPTD
肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌患者约占全世界的50%，在我国加强肝癌的防治研究意义重大。随着分子免疫学、肿瘤免疫治疗学的迅猛发展，使免疫治疗可能成为治疗肝癌的有效手段［1～3］。主动特异性免疫治疗即肿瘤疫苗因其特异性高、针对性强又成为免疫治疗的方向与主流。寻找肿瘤特异性/相关性抗原，增强其免疫原性，提高肿瘤免疫治疗的效果已经成为肿瘤疫苗研究的核心问题。因此，本研究拟采用肝癌中高表达的AFP、MAGE-1分子作为模式肿瘤抗原，从抗原递呈方式角度提高肝癌复合表位的免疫原性，为基于CTL表位肽的肝癌免疫治疗打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料 DNA限制性内切酶（EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ）；PCR产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自博大生物公司；原核表达载体pET22b为Novagen公司产品，原核表达载体pBVIL1由本室构建并保存［4］；Ni-NTA superflow 购自 QIAGEN公司；ELISPOT检测采用法国DIACLONE公司的Murine IFNγ ELISPOT 试剂盒；多肽由上海博亚生物公司合成与纯化，纯度达90%以上；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。
1.2 肝癌复合表位基因的克隆 选取肝癌高表达的AFP和MAGE-1作为模式肿瘤抗原［5～8］，选中6个CTL表位作为研究对象，以-NG-为连接臂对各表位加以连接［9］。以HIV Tat蛋白的47～57位氨基酸和通用PAPRE表位作为Tat 序列。
人工合成Tat（中间含EcoRⅠ、BamHⅠ）和多表位基因。通过原核表达载体pET22b将Tat和多表位基因连接。将含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因加入6个his分别克隆于原核表达载体pBVIL1中，构建原核表达载体pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T，并对其进行酶切及DNA序列鉴定。
1.3 目的蛋白的表达、纯化 挑取单个克隆于37℃振荡培养过夜，次日按1%接种量接种于LB（Amp+）培养基中，37℃活化至A值达0.4～0.6时，42℃水浴摇床继续培养5h，收集菌体，取1ml诱导后的菌体沉淀15%SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，选取表达量最高的作为蛋白纯化的工程菌。
制备包涵体，选用Ni-superflow进行重组蛋白的纯化，具体步骤按说明书进行。收集各部分洗脱峰，SDS-PAGE鉴定。凝胶过滤脱盐复性重组蛋白。
1.4 小鼠免疫方案 进行将6周龄Balb/c小鼠分为A～C组，每组6只。A组为Tat+T重组蛋白组；B组为T重组蛋白组；C组为PBS对照组。重组蛋白免疫初次采用与弗氏完全佐剂1:1混合，50μg/只，皮下多点和腹腔注射免疫小鼠；加强免疫使用弗氏不完全佐剂，皮下多点和腹腔注射免疫小鼠。初次免疫后，分别于第3周和6周各加强1次。末次免疫后2周处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，分离脾细胞作为效应细胞，用于IFN-γ的ELISPOT检测抗原的细胞免疫反应。
1.5 免疫小鼠脾淋巴细胞的分离 断颈处死小鼠，无菌取出脾脏，在 200目不锈钢网上研磨脾组织。将脾细胞悬液8ml缓慢沿管壁加入装有4ml Ficoll淋巴细胞分离液的透明离心管中，1500r/min离心20min，小心吸取白膜层，用10ml预冷的培养基洗2次。计数分离得到的淋巴细胞，最后将细胞重悬于20%胎牛血清的RPMI1640培养基。
1.6 免疫小鼠IFN-γ的ELISPOT检测 ELISPOT检测具体操作按Murine IFNγ ELISPOT 试剂盒产品说明书进行，主要步骤如下：（1）在用100μl/孔70%乙醇清洗ELISPOT板，室温下放置10min；（2）弃去乙醇，100μl/孔PBS洗板3次；（3）用10ml PBS稀释100μl捕获抗体（capture antibody），混匀，加入PVDF板中，100μl/孔，4℃静置过夜（16h）；（4）次日清空孔内液体，100μl/孔PBS洗板1次，加入100μl/孔2%脱脂奶PBS，室温封闭2h；（5）轻轻晃动ELISPOT板，弃去孔内液体，在纸上轻轻拍干，100μl/孔PBS清洗1次；（6）在每孔中加入合适浓度的细胞悬液和刺激原混合液共100μl，盖好板盖，于37℃ 5%CO2孵箱中培养20h；（7）轻轻晃动ELISPOT板，清空孔内液体，在纸上轻轻拍干；（8）加入100μl/孔洗液（含0.1%Tween20的PBS），4℃静置10min；（9）100μl 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，每次静置1min；（10）用10ml 1% BSA 的PBS稀释100μl检测抗体（detection antibody），混匀，每孔加入100μl，37℃ CO2孵箱中孵育1.5h；（11）清空孔内液体，100μl 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次；（12）用1%BSA PBS稀释链亲和素标记的碱性磷酸酶（Streptavidin-Alkaline Phosphatase Conjugate），每孔加入1:5000的稀释酶液100μl，37℃孵育1h；（13）清空孔内液体，100μl 0.1%Tween20 PBS清洗ELISPOT板3次，拍干ELISPOT板直至没有残留液体；（14）在每孔中加入100μl即用型BCIP/NBT底物反应液。室温避光显色2～10min，肉眼观察斑点的形成；待斑点形成后，用蒸馏水终止反应；（15）拍干ELISPOT板，4℃放置过夜，ELISPOT仪读取结果（ImmunoSpot 3.2 Beta 1软件），室温避光保存。
2 结果
2.1 原核表达载体pBVIL1/T、pBVIL1/Tat+T的构建与鉴定 将Tat、多表位（T）基因克隆于原核表达载体pET22b,构建原核表达载体PET/Tat、PET/T,用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切PET/Tat和T基因，连接转化大肠杆菌JM109，连接Tat和多表位基因。
将含Tat PTD及不含Tat PTD的肝癌多表位基因克隆入原核表达载体pBVIL1，原核表达载体的构建过程见图1。酶切鉴定pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的阳性克隆，经测序与设计序列完全一致，成功构建的原核表达载体可进行表达纯化。
2.2 目的蛋白的诱导表达与纯化 将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌HB101，工程菌经IPTG诱导后，经 15% SDS-PAGE电泳pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T分别在分子量22×103和21×103处出现一新增的蛋白条带，其大小与预计值相符，而空载体pBVIL1对照表达17×103的蛋白条带。融合蛋白主要以包涵体形式表达（图2）。
我们对不同的诱导条件进行了摸索，如诱导时的菌液浓度、诱导培养时间等。最终确定诱导前培养约2.5h至A达0.5，42℃诱导5h为最佳条件,进行重组蛋白的大量诱导表达与纯化。采用Ni柱法纯化目的蛋白，洗脱峰中的目的蛋白纯度较高（图3）。
2.3 ELISPOT检测免疫小鼠IFN-γ ELISPOT结果示意图见图4。检测结果显示：A组（重组蛋白Tat+T免疫组）产生的斑点数明显多于B组（重组蛋白T免疫组）和PBS对照组，差异有显著性（P<0.05）。含Tat融合肽的重组蛋白Tat+T比不含Tat融合肽的重组蛋白T产生的细胞免疫反应水平高（图5）。图1 原核表达载体pBVIL1/Tat+T、pBVIL1/T的构建示意图
3 讨论
如何评价肿瘤抗原特异性T细胞反应，是抗肿瘤免疫治疗的基础。从T细胞免疫反应检测的方法来看，ELISPOT法是近年来逐步建立起来的通过检测细胞因子来评价T淋巴细胞功能和特异性的新方法，可检测单细胞水平上的细胞因子产生、分泌情况。这一方法的特异性和敏感性都很高，广泛应用于CTL表位鉴定，疫苗疗效监测［10～14］。自从首次发现TatPTD的转导活性以来［15～17］，这一特性为将目的分子引入细胞提供了一条崭新的途径。蛋白疫苗形式虽然安全可靠，但较难引发CTL细胞免疫反应，究其原因与外源蛋白通常进不了细胞而不能进入MHC-类分子介导的抗原呈递途径有关,这也极大地限制了利用重组蛋白疫苗来诱发CTL免疫应答的研究。Kim等［18］将卵清蛋白(OVA)与TatPTD融合,加入到APC体外培养细胞后,融合蛋白跨膜导入细胞并进入MHC-Ⅰ类分子介导的抗原呈递途径,从而激活了CD8＋的T淋巴细胞，而且用TatPTD融合蛋白免疫小鼠后也可激发抗原特异性CTL的免疫应答。此项研究拓展了重组蛋白疫苗的应用范围,有望在激活体液免疫的同时激活细胞免疫。研究表明TatPTD融合蛋白可改善基于蛋白质的肿瘤免疫治疗，为肿瘤亚单位疫苗提供了新的研究策略［17］。本研究中应用TatPTD融合蛋白免疫动物，确实能有效诱导细胞免疫反应，ELISPOT斑点数优于不含TatPTD的蛋白组。以上结果表明，TatPTD融合形式的复合表位在肿瘤免疫治疗中有很好的应用前景。
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(编辑：李 木)
作者单位：100850 北京，军事医学科学院基础医学研究所