点击显示 收起
【摘要】 目的 采用穹隆-海马伞切断及去势的大鼠模型模拟阿尔茨海默病病人，观察模型大鼠脑内不同部位β淀粉肽1-40(Aβ1-40)表达的变化，了解A β1-40与阿尔茨海默病（AD）相关的发病机制。方法 将大鼠分为穹隆-海马伞切断组、去势组（模型组）和假手术组，假手术组除了不切断穹隆-海马伞和去除卵巢外，其余步骤同模型组。常规处死大鼠取脑组织行A β1-40免疫细胞化学染色，观察海马CA1区、皮质区、杏仁复合体区、基底前脑Meynet核等部位Aβ1-40阳性细胞表达变化。结果 假手术组大脑各观察区有少量的Aβ1-40表达，与假手术组比较，模型组大脑海马CA1区、皮质区、杏仁复合体区、基底前脑Meynet核Aβ1-40阳性细胞数明显增多（t=3.969～6.677,P<0.01）。结论 穹隆-海马伞切断和去势的大鼠脑内多部位Aβ1-40表达增多，此可能与老年性痴呆病理改变有关。
【关键词】 穹隆 海马伞 淀粉样β蛋白 阿尔茨海默病 大鼠 Wistar
Expressive varieties of β-amyloid peptide 1-40 in brain of AD
ZOU Chun-jie，BI Hong-ying.Heilongjiang Provincil Second Healthy School,Harbin 150006,China
【Abstract】 Objective To observe the expressive varieties of β-amyloid（A β1-40）peptide in different sections of the rat brain with fimbria/fornix transaction and to study the pathogenic mechanisms related to Alzheimer disease(AD).Methods Health female Wister rats were randomly divided into the model group and control group with five rats in each group.The fimbria/fornix transection and ovaries cutting were simultaneously performed for the animal model.The rats were executed and the brain taken conventionly.The Aβ1-40 immunocytes were stained by using an immunohistochemical technique.The expressions of the Aβ1-40 positive cells in the hippocampi CA1,cortex,amygdale,Meynert of the basal forebrain were observed.Results A little A β1-40 was expressed in the observed sections of the brain in the control group,while the A β1-40 positive cells in the model group were significantly increased than those in the control group in the hippocammpiCA1,cortex,and amygdale(t=3.969～6.667,P<0.01).Conclusion Fimbria/fornix transaction cutting can cause the increased of Aβ1-40 expression in many sections of the brain, which might be related to the cognitive disturbance due to Alzheimer disease.
【Key words】 fornix; hippocampus fimbria; β-amyliod protein; Alzheimer disease;rats;Wistar
β淀粉样肽是淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的代谢产物，是老年斑的主要成分，其中以β-淀粉样肽1-40（Aβ1-40）为主。雌激素与APP的代谢过程密切相关［1］。阿尔茨海默病（AD）是一种以认知障碍为主要特征的进行性神经系统疾病，在美国AD发病年龄一般在65岁以上，80岁以上的患病率为40%，男女均可发病，但女性病人是男性的2～3倍，研究表明，女性AD病人体内的雌激素缺乏与AD发病有关［2］。大鼠卵巢切除（VOX，去势）是一种较好的雌激素缺乏模型［3］，结合穹隆-海马伞切断可以造成大鼠体内雌激素缺乏和脑内胆碱能神经远端支配区的乙酰胆碱（Ach）功能下降，恰似老年妇女AD体内递质的变化［3，4］，应用这种模型观察大鼠脑内的病理改变，尤其是APP等的代谢状态，是否产生A β1-40和老年斑等，对于探讨AD的病理变化具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 实验动物和分组 成年健康雌性Wistar大鼠。由青岛市药物研究实验中心提供，5个月龄，体重210～250g。常规饲养，环境温度22℃，随机分为穹隆-海马伞切断加去势组（模型组）和假手术组，每组大鼠5只。
1．2 模型制作
1．2．1 双侧穹隆-海马伞切断 经100g/L水合氯醛（300mg/Kg,皮下注射）麻醉后，将大鼠固定于江湾IC型脑立体定位仪，常规消毒、剪毛、正中切开头皮，暴露出颅骨，参照Paxinos和Waston的大鼠脑立体定图谱［5］，在前卤后2.2～2.5mm，中线外1.0mm处，用电动开颅器凿开 颅骨，切开硬脑膜，用自制双刃刀置上述部位脑表面，接着降刀4.5mm，外移1.0mm，然后再降刀1.0mm，外移1.5mm，最后上下抽动刀约20次，以保证海马伞外侧缘完全切断。清洁颅面，缝合头皮，常规饲养［4，6］。
1．2．2 VOX方法 经10%水合氯醛（35～40mg/kg,ip）麻醉后，先使动物右侧卧位，在腰背部脊柱旁和最末肋骨下约1cm剪开皮肤，切口约2～3cm，沿脊柱旁切开肌肉，打开腹腔，将肾脏下方的脂肪拉出后可见有一红色颗粒样腺体，此即是埋在脂肪内的卵巢，结扎并切除卵巢，观察无出血后关闭腹腔；再使动物转向左侧侧卧位，以同样的方法取出右侧卵巢［9］。
1．2．3 假手术组处理 大鼠除了不切断海马伞和去除卵巢外，其余处理同模型组。术后观察大鼠1个月后处死。
1．4 大鼠脑组织病理观察 100g/L水合氯醛麻醉大鼠（300mg/kg），暴露心脏，以生理盐水200ml经升主动脉冲洗，再灌注40g/L多聚甲醛200～300ml固定，持续30min后取脑备用。取材范围为前囟后2.0～5.0mm和前囟后2.0mm至前囟前0.3mm。脑组织常规脱水、透明、浸蜡包埋，连续冠状切片（切片厚度5μm），用于免疫组化观察。
1.5 免疫组化染色 切片经0.01mol/L PBS溶液漂洗3次，每次10min；浸入Aβ1-40抗体（1：200，博士德公司）孵育，4℃过夜，或37℃孵育1h，0.01mol/L PBS溶液漂洗3次，每次10min，入生物素化兔二抗（博士德公司）孵育2h，0.01mol/L PBS溶液漂洗3次，每次10min，入ABC复合物（博士德公司）孵育2h，0.01mol/L PBS溶液漂洗3次，每次10min，蒸馏水快洗3次。用硫酸镍铵加强的DAB法核对色，镜下控制时间，蒸馏水终止反应，干燥、脱水、透明、封片，光镜观察。阴性对照用0.01mol/L PBS替代一抗，其余步骤相同。
1．6 定量分析记数和统计学处理 参考Paxinos和Watson编写的大鼠脑图谱［5］，Olympus光学显微镜下（10×40倍）观察海马CA1区、皮质区、杏仁复合体区、基地前脑 Meynet核等部位Aβ1-40阳性细胞的数量，用x±s表示，统计处理采用t检验。
2 结果
假手术组大脑各观察区有少量的A1-40表达，与假手术组比较，模型组大鼠海马CA1区、皮质区、杏仁复合体区A1-40阳性细胞的数量均显著增多（t=3.969～6.677,P<0.01）。见表1。 表1 两组脑内不同部位A β1-40阳性细胞数量比较
3 讨论
APP是一种跨膜蛋白，Aβ蛋白是APP断裂后产生的残基多肽。神经细胞存在大量的APP，生理条件下，多数APP由α分泌酶裂解成可溶性的APP肽，APP肽再进一步被γ分泌酶裂解产生P3。极少部分的APP在胞质溶酶体经β分泌酶和γ分泌酶裂解为A β1-40。在某些病理条件下如APP基因突变，产生过多的Aβ1-40，导致AD发病。在AD病人的老年斑和类淀粉血管病的血管壁中，均可见到Aβ的沉积［7～9］。
Aβ1-40对神经细胞可以产生直接的毒性，也可以增强或放大各种伤害刺激，如低糖血症、兴奋毒性、自由基等的细胞损伤效应。多数细胞与Aβ1-40结合以后，会出现细胞肿胀，染色体浓缩，核内DNA断裂等细胞凋亡的典型特征和生化特征［10］。雌激素影响靶组织的生长、分化和功能发挥。卵巢切除的病人和自然绝经后妇女会出现学习和记忆的减退，情感异常，焦虑等变化，严重者出现认知功能障碍，人格改变和近期记忆丧失，发展为AD。
生理浓度的17β-E2可使人乳癌细胞株ZR751培养基中可溶性淀粉样蛋白生成增多，而细胞内成熟或未成熟APP并无明显变化。提示雌激素是通过影响APP的分泌代谢机制而促进了可溶性淀粉样蛋白的生成。切除卵巢的大鼠APP mRNA表达2h内增加67.9%,大量的APP经β分泌酶降解，使Aβ1-40和Aβ1-41的释放增多［11］。进一步研究表明，由于基底前大脑皮质及海马部位雌激素受体与神经生长因子受体位于同一位点，雌激素通过神经生长因子介导激活蛋白激酶C（PKC），PKC又增强α分泌酶的活性，因而激活了可溶性淀粉样蛋白的生成途径。Aβ1-40在脑内沉积导致神经元细胞死亡，雌激素可阻断这种毒性作用［12］。
Gibbs［13］观察到神经生长因子受体（TrkA）、胆碱乙酰化转移酶(ChAT)和雌激素受体（ER）共存。内侧隔核和斜角带核内95%以上TrkA免疫反应阳性神经元内含有ChAT；Meynert核内80%以上TrkA免疫反应阳性神经元内含有ChAT、ER。穹隆-海马伞切断损伤了共同的物质基础。
本研究结果显示，模型组大鼠脑内海马CA1区、皮质区、杏仁复合体区Aβ1-40阳性细胞的数量均显著增多，说明胆碱能神经的失活和体内雌激素水平的下降，不仅导致了乙酰胆碱的含量减少，而且也导致了APP代谢异常产生过多A1-40，加重了神经的蜕变损伤。
基底前脑Meynert核发射纤维至杏仁复合体区。边缘皮质、丘脑、下丘脑、杏仁复合体、基底前脑等组成以Papez内环路为中心将各部分有机地联系在一起的系统，对情绪、动机、学习及记忆产生重要的作用［14，15］。AD病人临床出现学习、记忆以及情绪等的变化，可能与此机制有关。胆碱能系统的蜕变和雌激素的下降，是否影响到杏仁复合体系统的神经细胞Aβ1-40的变化，目前尚无报道。本文在穹隆-海马伞切断加去势模型大鼠脑内观察到，杏仁复合体部位的神经细胞Aβ1-40阳性细胞明显增多，说明神经细胞的APP代谢受到损伤，这可能是痴呆病人发病以及情绪异常的原因。
【参考文献】
1 Scott A,Lyness SA,zarow C,et al.Neuron loss in key cholinergic and aminergic nuclei in Alzheimer disease;a meta-analysis.Neurobiology Aging,2003,24:1.
2 Bieber EJ,Cohen DP.Estrogen and hormone replacement therapy; is there a role in the preservation of cognitive function.Int J Fertile Womens Med,2001,46(4):206.
3 Singh M,Meyer EM,Millard WJ,et al.Ovarian steroid deprivation results in a reversible learning impairment and compromised cholinergic function in female SD rats.Brain Res,1994,644:305.
4 Ute K,Bigl V,Eschrich K,et al. De-afferentation of the septo-hippocampal pathway in rats as a model of the metabolic events in Alzheimer,s disease.Int J Devl Neuroscience,2001,19:263.
5 PaxinosG,WatsonC.The rat brain in sterrotaxic coordinated.2nd.Australia:Academic Press Australia,1988,23-38.
6 He YS,Yao ZB.NGF promotes collateral sprouting fiber in the septo-hippocapal transaction.Brain Res,1990,586:27.
7 盛树力.老年性痴呆：从分子生物学到诊治.北京：科学技术出版社，1998,73-104.
8 Morgan C,Bugueno MP,Garrido J,et al.Laminin affects polymerization,depolymerization and neurotoxicity of Aβ peptide.Peptides,2002,23:1229.
9 Dumery L,Bourdel F,Soussan Y,et al.β-amyloid protein aggregation: its implication in the physiopathology of Alzheimer’s disease.Pathol Boil,2001,49:72.
10 Casaccia-Bonnefil P,Carter BD,Dobrowsky RT,et al.Death of oligodendrocyted by the interaction of nerve growth factor with its receptor.Nature,1996,383:716.
11 Oliveri G,Novakovic M,Savaskan E,et al.The effects of β-estradiol on SHSY5Y neuroblastoms cell during heave induced oxidative stress neurotoxicity and β-amyloid secretion.Neurosceience,2002,113(4):849.
12 Wise PM,Dubal DB,Wilson ME,et al.Estradiol is a protective factor in the adual and aging brain:understanding of mechanisms derived from in vitro studies.Brain Research Reviews,2001,37:313.
13 gibbs rb.levels of trka and bdnf mRNA,but not NGF mRNA,fluctuate across the estrous cycle and increase in response to acute hormone replacement.Brain Res,1998,787:259.
14 朱长庚.神经解剖学.北京：人民卫生出版社，2002,705-725.
15 Dong HW,Petrovich GD,Swanson LW.Topography of projection from amygdala to bed nuclei of the stria terminalis.Brain Res Rev,2001,38:192.
作者单位：150006 黑龙江哈尔滨，黑龙江省第二卫生学校