青藏铁路沿线鼠疫菌生物学性状的研究*

【摘要】  目的 研究并检测青藏铁路沿线鼠疫菌生物学性状。方法 选择青藏铁路沿线鼠疫菌的生物化学试验、毒力因子、营养型、毒力、质粒、外膜蛋白和鼠疫菌对抗生素敏感性等项目。结果 试验用青藏铁路沿线菌株生化性状为甘油＋、鼠李糖－、阿胶糖＋、密二糖－、麦芽糖＋、脱氮＋等主要特征；具有鼠疫菌荚膜抗原(Fra I+ )、毒力抗原 (Vwa+ )、鼠疫菌素 I(Pst I+ )、色素沉着因子 (Pgm+ ) 4种毒力因子；对小白鼠的LD100在102～103个菌，LD50为7.94～31.62个菌，对豚鼠的LD100在105～107个菌，LD50为68.14～685.49个菌；营养型表现为对Trp、Thr、Leu、Arg不依赖，而对Phe、Met、Cys依赖，对Ile和Glu表现出低营养；携带6、45、52、65、92 Mdal质粒；在10%的SDS-PAGE上37℃条件下的培养物可表达26条外膜蛋白带，28℃培养物可表达36条外膜蛋白；部分头孢类和喹诺酮类药物对试验菌株的敏感性效果较好，19种抗生素均较链霉素为佳。结论 青藏铁路沿线的鼠疫菌属于典型的青藏高原型菌株，都是强毒型鼠疫菌，该项研究可为青藏铁路沿线的鼠疫防治措施提供科学的依据。

【关键词】  青藏铁路沿线；鼠疫菌；生物学性状；质粒；外膜蛋白

    A study on biological character of the Yersinia pestis along Qinghai-Tibet railway

    ZHANG Chun-hua, LV Jing-sheng, CONG Xian-bin,et al. Chinese Center for Disease Control and Prevention, The Base forControl and Prevention of Plague and Brucellosis , Baicheng  137000,China

    【Abstract】  Objective  To study and detect the biological character of the Yersinia pestis along the Qinghai-Tibet railway.Methods  To choice the Yersinia pestis biochemistry、virulence、nutrition、plasmid、outer membrane proteins、antibiotic sensitivity test.Results  The Y.pestis biochemistry character: glycerol +、rhamnose -、melibiose -、maltose +、denitrification +;there are FraI +、Vwa +、Pst I +、Pgm +;in animal experiment the white mouse LD100:102～103,LD50:7.94～31.62,the cavy LD100:105～107,LD50:68.14～685.49;the Yersinia pestis along Qinghai-Tibet railway depend on Phe、Met、Cys,did not depend on Trp、Thr、Leu、Arg and showed meiotroph of Ile、Glu;contains the plasmid of 6、45、52、65、92Mdal;there are 26 stripes of outer membrane proteins at 37℃ and 36 stripes at 28℃ in 10% SDS-PAGE electrophoresis;the Yersinia pestis is sensitive to some of cephalosporin and carbostyril,19 antibiotics is better than streptomycin.Conclusion  The Yersinia pestis along Qinghai-Tibet railway is standard strain of Qinghai-Tibet plateau ecotype,the research might provide scientific evidence for prevention and control of plague along the Qinghai-Tibet railways.

    【Key words】  along the Qinghai-Tibet railways;the Yersinia pestis;biological character;plasmid;the outer membrane proteins

    青藏铁路是我国西部大开发的标志性工程。青藏铁路沿所经过的青海海晏、刚察、天峻、乌兰、格尔木以及西藏的安多、那曲、当雄等县市均是鼠疫疫源地，也是人及动物鼠疫频发的地区。由于这一地区鼠疫菌具有独特的生物学特性，决定了人类和动物感染鼠疫后发病急、病情重、病程短、传染性强、病死率高，对人群和社会的危害非常严重。

    本项目主要从青藏铁路沿线鼠疫菌的生化特性、营养需求、毒力、毒力因子、质粒、外膜蛋白以及对抗生素敏感性七个方面进行试验研究，其目的是深入细致地了解该地区鼠疫菌生物学特征。以便为青藏铁路沿线鼠疫的防治提供科学依据。

    1  材料与方法

    1.1  菌株  分离到青藏铁路沿线18株强毒鼠疫菌，对照菌株有141标准菌株、EV菌、51041吉林省黄鼠菌株、02051青海省喜马拉雅旱獭菌株、32001西藏喜马拉雅旱獭菌株、87001云南黄胸鼠菌株和假结核05菌株(见表1),和EV菌携带6、45、65 Mdal质粒。表1  试验用菌株

    1.2  方法及培基

    1.2.1  生化试验  按照常规试管法［1］，包括甘油、鼠李糖、阿胶糖、密二糖、麦芽糖、脱氮等16项试验。

    1.2.2  毒力因子检查  鼠疫杆菌素I(PstI)检查按史书文介绍的方法［2］，指示菌为血清型I型假结核菌；Vwa抗原检测按文献［1］方法，采用草酸镁培养基；荚膜抗原FraI检查  用反相血凝方法；色素沉着因子(Pgm)检查用刚果红培养基。

    1.2.3  营养需求检测  按照何永山等［3］ 记述的方法进行，选用 Lawto氏最小培养基。

    1.2.4  鼠疫菌毒力测定  对小白鼠和豚鼠采用常规的动物接种试验，计算各试验菌株的绝对致死量（LD100）和半数致死量（LD50）。

    1.2.5  鼠疫菌质粒检测  采用Kado和Liu法提取鼠疫菌的质粒，经琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

    1.2.6  鼠疫菌外膜蛋白检测  鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳系统分离鼠疫菌外膜蛋白。

    1.2.7  鼠疫菌对抗生素敏感性测试  采用纸片法，应用20种抗生药物对青藏铁路沿线鼠疫菌进行敏感性测试。

    2  结果

    2.1  生化试验  试验用青藏铁路沿线菌株表现为甘油＋、鼠李糖－、阿胶糖＋、密二糖－、麦芽糖＋、 脱氮＋等主要特征，见表2。

    2.2  毒力因子检查  通过试验证实，试验用青藏铁路沿线菌株都具PstI+、VWa+、FraI+、Pgnn+ 4种毒力因子，见表3。表2  试验用菌株生化测试结果表3  毒力因子检查结果   

    2.3  营养需求检测  试验结果表明，试验用青藏铁路沿线菌株在Lawton氏最小培养基上或加入色氨酸（Trp）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）和精氨酸（Arg）都可生长；从Lawton氏最小培养基中减去异亮氨酸（Ile）、谷氨酸（Glu）也能生长，但从Lawton氏最小培养基中减去苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys）不能生长。说明试验用青藏铁路沿线菌株对Trp、Thr、Leu、Arg不依赖，而对Phe、Met、Cys依赖，对Ile和Glu表现出低营养，见表4。

    2.4  鼠疫菌毒力测定

    2.4.1  鼠疫菌对小白鼠的毒力  试验用的6株鼠疫菌对小白鼠均有较强的毒力，绝对致死量（LD100）在102～103个菌，半数致死量（LD50）为7.94～31.62个菌，见表5。

    2.4.2  鼠疫菌对豚鼠的毒力  试验用的6株青藏铁路沿线鼠疫菌对豚鼠同样具有很强的毒力，绝对致死量（LD100）在105～107个菌，半数致死量（LD50）为68.14～685.49个菌，见表6。表4  营养需求试验结果注：+生长（不依赖），    －不生长（依赖）表5  试验菌株对小白鼠毒力试验结果

    2.5  鼠疫菌质粒检测  经试验研究证明，青海省天峻县、乌兰县、刚察县、海晏县12株鼠疫菌中有11株携带6、45、52 Mdal质粒，其中青海省乌兰县1株鼠疫菌携带6、45、65 Mdal质粒，见图1。青海省格尔木和西藏那曲鼠疫菌携带6、45、92 Mdal质粒。由此，可绘制出青藏铁路沿线鼠疫菌携带6、45、52 Mdal,6、45、65 Mdal和6、45、92 Mdal 3种质粒图谱，见图2、图3。图1  试验用菌株质粒检测结果

    菌株从左至右：1EV、2～4青海天峻、5吉林黄鼠、6～8青海乌兰、9～11青海刚察、      12～13青海海晏、14青海祁连图2  试验用菌株质粒检测结果       

    菌株从左至右：1EV、2吉林长岭、3青海祁连、4西藏红海、5青海天峻、6乌兰、7刚察、8海晏、9青海格尔木、10西藏那曲、11青海天峻、12乌兰、    13海晏、14云南瑞丽 图3  试验用菌株质粒检测结果

    菌株从左至右：1EV、2青海祁连、3西藏红海、4～6西藏那曲、

    7～9青海格尔木、10青海刚察、11青海海晏、12西藏红海、

    13吉林长岭、14云南瑞丽2.6  鼠疫菌外膜蛋白检测  试验用的青藏铁路沿线鼠疫菌在10%的SDS-PAEG上，37℃条件下的培养物所表达的外膜蛋白为26条蛋白带，其分子量分别是：119、116、111、103、97、94、90、87、84、79、73、70、65、62、58、52、47、42、39、36、34、32、30、29、26、24KD，见图4。 图4  试验用菌株37℃外膜蛋白检测结果

    菌株从左至右：1EV、2～3青海天峻、4～5青海乌兰、6～7青海刚察、8～9青海海晏、10～11青海格尔木、12～13西藏那曲、14 EV、15Mark

    在同样电泳条件下28℃培养物表达的外膜蛋白为36条蛋白带，其分子量分别是：119、116、111、103、97、94、90、87、80、73、70、68、65、62、58、56、53、50、48、47、42、39、38、36、35、34、32、30、29、27、26、25、24、22、19、16 KD，见图5。图5  试验用菌株28℃外膜蛋白检测结果

    菌株从左至右：1EV、2～3青海天峻、4～5青海乌兰、6～7青海刚察、8～9青海海晏、10～11青海格尔木、12～13西藏那曲、14 EV、15Mark

    2.7  鼠疫菌对抗生素敏感性测试  通过对18株鼠疫菌的药敏试验，结果表明，我们试验用的21种抗生素对鼠疫菌的药敏结果均较链霉素为佳。具体敏感程度的顺序为：PIP＞CB＞CTX＞CF＞CRO＞LMF＞ENO＞CIP＞NOR＞GTF＞CFP＞CFX＞FLE＞AM ＞OFL＞CPM＞CMZ＞PEF＞CEP＞SXT＞S。具体试验结果详见表7。表7  鼠疫菌对抗生素敏感性试验结果注:(1)表内数据为18株鼠疫菌所得结果之平均值； (2)药敏纸片直径6mm

    3  讨论

    研究鼠疫菌的生物性状可以直接反映鼠疫菌对宿主的致病性及其在流行病学中的意义。作为一个独立类型的鼠疫自然疫源地其中一个主要的因素就是要有一个和主要宿主相互适应的鼠疫菌，以便此类型鼠疫在该疫源地长期保存的流行，形成鼠疫的自然疫源性［4］。

    鼠疫菌的生化特性主要与宿主、媒介及其地理环境等因素有关，是地理环境生物群落综合作用长期自然进化选择的结果。在我国宋延富依据鼠疫菌生化试验，将我国鼠疫菌划分为12个生物型。各生物型有特定的地理分布，可以表现出不同疫源地内不同型鼠疫菌生化特征［5］。纪树立等对我国11个省、自治区分离的418株鼠疫菌进行糖醇酵解，脱氮，营养型等，将我国鼠疫菌分成l7个生态型。17个型鼠疫菌均各有特定的地理位置，对人的侵袭力、致病性亦各有不同 ［6］。

    分离自青藏铁路沿线的鼠疫菌也同样反映出其宿主生理条件、地理分布与生化性状的关系。从试验结果可以看出，青藏铁路沿线的鼠疫菌的生物学性状具有独自的特点，即表现为甘油＋、鼠李糖－、阿胶糖＋、密二糖－、麦芽糖＋、脱氮＋；具有野生强毒菌所特有的PstI＋、VWa＋、FraI＋、Pgnn＋ 4种毒力因子；对小白鼠的半数致死量为7.94～31.62个菌，对豚鼠的半数致死量为68.14～685.49个菌，虽然试验用的菌株毒力存在差异，但对小白鼠和豚鼠均有较强的毒力，青藏铁路沿线的鼠疫菌都是强毒型鼠疫菌；该地区鼠疫菌的营养需求表现出对色氨酸（Trp）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）和精氨酸（Arg）不依赖，而对苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys）依赖，对异亮氨酸（Ile）、谷氨酸（Glu）表现出低营养；试验所用青藏铁路沿线18株鼠疫菌，携带的质粒种类有6、45 Mdal，大质粒分别为52 Mdal或65 Mdal或92 Mdal。

    鼠疫菌能分泌一组由温度调控、PCD1质粒编码的高标准表达的毒力蛋白（Yops）和V抗原（LcrV），其合成与分泌的条件是，在体外缺钙、37℃条件下合成并分泌Yops和LcrV产物，这一分泌过程由Ⅲ型分泌系统调控［7］。本试验对青藏铁路沿线不同疫源县的12株鼠疫菌进行了外膜蛋白研究，发现各疫源县鼠疫菌具有共同的外膜蛋白带。但37℃条件下和28℃条件下所产生的外膜蛋白带不同。根据张春华［8］等关于鼠疫菌外膜蛋白分型的报道可将试验用的菌株划归为YOP1型。

    本项研究较全面地开展青藏铁路沿线鼠疫菌生物化学特性、营养需求、毒力、毒力因子、质粒、外膜蛋白等生物学性状和药物敏感性的研究。根据该项研究结果，在鼠疫治疗中可以考虑使用头孢类药物、喹诺酮类药物及羧苄青霉素等新型抗生素来取代链霉素，预防性投药选用口服药物磺胺甲恶唑/甲氧苄啶为佳。该研究结果可为青藏铁路沿线鼠疫的防治及其制定监测技术措施和临床治疗提供鼠疫病原学方面的科学依据。

【参考文献】
  1 张春华，俞东征. 鼠疫病原学.中国地方病防治杂志编辑部，1999，65-88.

2 史书文，陈淑媛，白庆奎.鼠疫菌鼠疫菌素I的产生和对鼠疫菌素I敏感性的研究.鼠疫论文专刊，47.

3 何永山，公允.鼠疫菌营养型差异的研究.鼠疫论文专刊，1983，15.

4 丛显斌，曹淑兰，张春华,等.青海田鼠型鼠疫耶尔森氏菌生物学性状的研究. 中国地方病学杂志，2002，21（4）：269.

5 宋延富．中国鼠疫菌生物型及其流行病学意义．中国地方病学杂志，1989，8(2)：93.

6 纪树立，张海峻，刘云鹏，等.我国鼠疫菌分型及其生态学、流行病学意义. 鼠疫论文专刊，1983，（分型）：1.

7 Day JB, Ferracci F, Plano GV.Translocation of YopE and YopH intoeukaryotic cells by Yersinia pestis yopH,tyeA,sycN,yscB and LcrG deletion mutants measured using a phosphorylatable peptide tag and phosphospecific antibodies. Mol Microbiol,2003,47(3):807.

8 张春华,丛显斌, 王忠惠，等. 中国鼠疫菌外膜蛋白种类及在基因分型中的应用.中国地方病防治杂志，2005，20（4）：193.

作者单位：137000 吉林白城， 中国疾控中心鼠疫布氏菌病预防控制基地