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【摘要】 目的 研究我国口岸检出的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）感染者的HIV-1 gag区基因序列特征，了解亚型种类，为艾滋病的监控和防制提供科学依据。方法 从HIV阳性的出入境人员血浆中提取病毒核酸，之后采用RT-PCR法扩增gag区基因，对该段序列进行测定分析。结果 2004～2006年确认的39例HIV阳性标本，根据gag区基因序列系统树分析显示，共有8种亚型，其中12例C亚型，9例CRF01_AE重组，6例CRF07_BC重组，5例CRF08_BC重组，4例B亚型，1例B’亚型，1例CRF02_AG重组和1例A1亚型。结论 北京口岸检出的HIV-1亚型种类较为复杂，研究口岸艾滋病病毒的变异特点和传播来源对于我国艾滋病的防治具有重要作用。
【关键词】 HIV-1；gag基因；亚型分析
HIV-1 gag gene sequencing and subtype analysis in China entry-exit port population
ZHU Hong,LIU Jian-li,DONG Hua-huang.Beijing Quarantine Bureau of National Boundary,Beijing 100013，China
【Abstract】 Objective To analyze gag sequence characteristics of HIV-1 infected people found at China port，to learn subtype and to provide scientific reference for AIDS supervision and control in China.Methods To extract HIV-1 RNA from HIV positive plasma from entry-exit populations，then HIV-1 gag gene were amplified by RT-PCR and sequence was analyzed.Results Phylogenetic tree analysis showed that there existed 8 kinds of subtype among 39 HIV positive samples confirmed from 2004 to 2007，consisting 12 cases of C，9 cases of CRF01_AE，6 cases of CRF07-BC，5 cases of CRF08_BC，4 cases of B ，1 case of B’，1 case of CRF02_AG and 1 case of A1. Conclusion The subtypes of HIV-1 tested at China port were complex and research on HIV variation characteristics and spreading source at port will play an important role in AIDS preventation and treatment.
【Key words】 HIV-1; gag gene; subtype analysis
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一类死亡率极高的传染性疾病，对全球、尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民的生命健康安全威胁极大［1］。到目前为止，根据不同的地理区域可将HIV-1分为M组、O组和N组，到目前为止，其中占全球HIV-1流行毒株90%以上的M组按其gag基因和env基因的变异程度又可分为9种单一亚型（A～D,F～H,J和K）和19种循环重组型（CRF01至CRF19）（Los Alamos National Laboratory ［http://www.hiv.lanl.gov］）。已发现不同亚型在不同地区和不同高危人群中的分布不同［2,3］，出入境人员是一个来自世界各地的复杂而具有特殊意义的群体，对于我国HIV的传入传出以及今后的流行趋势具有重要的意义。因此对我国质检系统检出的出入境HIV-1感染者进行了病毒基因亚型鉴定和基因序列分析，从而为我国艾滋病的防治策略提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 受检人员为国外入境人员及中国出入境人员。包括由国家质量监督检验检疫总局以及北京国际旅行卫生保健中心HIV确认实验室检出的共39份出入境人员HIV抗体阳性血浆样品，予-20℃保存。
1.2 核酸的提取 采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取血浆HIV病毒核酸RNA。
1.3 gag基因的PCR扩增 针对gag基因的引物（见表1）由北京赛百盛基因技术有限公司合成，用无核酸酶的水配成应用浓度。以GAG-L和GAG-E2为外引物，GUX和GDX为内引物，采用TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司的One-step RT-PCR试剂盒对gag基因进行扩增。PCR反应条件为：第一轮外侧引物扩增时，50℃30min，94℃5min，55℃1min，72℃2min，1个循环；94℃30s，55℃45s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。第二轮内侧引物扩增时，94℃2min，55℃1min，72℃90s，1个循环；94℃30s，55℃45s，72℃90s，30个循环；72℃ 10min；4℃保温。PCR反应体系见表2。表1 gag区扩增引物一览表表2 HIV-1 gag基因序列扩增反应体系
1.4 基因测序和序列分析 以GUX和GDX为测序引物，在BioRad公司PCR仪上用Taq酶进行双向测序反应后，在PEABI公司377型DNA自动测序仪上测定和修正序列。测得的序列用美国ABI公司的Seq ED软件进行编辑校正，再用CExpress软件进行拼接，之后利用美国生物技术信息中心(NCBI)的新序列相似性检索(BLAST)程序将测得序列与国际参考HIV-1分离株序列进行同源性比较，根据最大相似性原则确定HIV-1亚型。以BioEdit软件对序列进行排列和比较；用Distances程序计算氨基酸序列的同源性；用Mega软件的Neighbor-joining法绘制系统树；HIV-1各亚型（A亚型、B亚型、B’亚型、C亚型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF02_AG）国际标准参考序列从美国Los Alamos HIV基因数据库网站下载。
2 结果
2.1 一般流行病学调查结果 本次研究采集的标本来自国外入境人员和本国出入境人员。样本基本信息见表3。以男性居多，性接触为主要感染途径，职业分布有驾驶员、农民、按摩女、导游、商人、干部等。表3 不同性别和职业的HIV-1感染者感染途径分布
2.2 基因扩增和亚型分析 血浆RNA提取，gag基因区部分序列扩增，1%琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.15μg/ml)电泳，通过标准分子量DNA比较，紫外灯下观察出现特异条带。扩增片断大小约1000bp，将所测序列提交到美国Los Alamos HIV基因数据库中进行比对结果，39例样本共呈现出8种亚型（表4），分别为：12例C亚型，9例CRF01_AE，6例CRF07_BC，5例CRF08_BC，1例CRF02_AG，1例A1亚型，4例B亚型和1例B’亚型。表4 不同国籍来源的HIV-1阳性标本的亚型分布
2.3 HIV-1 gag基因序列系统树分析 将39例感染者的HIV-1病毒gag基因区部分序列与各亚型的几株代表性的国际参考序列排列比对，进一步由系统进化树结果（见图1）可见，39例标本中有10例（001，0502，0522，RL010，RL013，RL017，RL021，RL028，RL031和RL034）的基因序列聚集在C.IN.95. 95IN21068周围；2例（0455与0406）聚集在C.ZA.03ZASK033B2周围；有9例（RL038，RL035，RL032，RL029，RL027，RL023，0601，0623和420）与01 AE.TH.90聚集；有4例（RL033，RL036，003和0534）与B.FR.83.HXB2LAIIIIB BRU聚集；有6例（RL025，RL020，RL019，RL018，RL014，404）与07BC. CN.97.CN54接近；有5例（006，RL022，RL026，RL030和RL037）与08 BC.CN.97. 97CN GX接近；1例0439接近02 AG.NG. IBNG；1例409接近A1 SE.94.SE7253；另外还有1例004与15_01B.TH.99.99TH_ MU2079距离最近。
2.4 与各亚型国际参考株的基因距离结果 应用Mega软件的Distance程序将研究毒株与国际参考毒株进行基因距离比较，结果见表5。表5 39株毒株与国际参考株进行亚型比对的基因距离
3 讨论
我国分子流行病学调查显示，目前中国存在着很广泛的HIV-1亚型种类，主要有A、B、B’、C、D、F和G以及重组型CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC，其中B/B’居多，占将近一半，其次为CRF08-BC和CRF01-AE［4～6］。近年来，我国的HIV种类日趋复杂，从国外引入新的毒株是一个重要因素。口岸检测出的毒株来源范围广，犹如一个集中了世界各地毒株的窗口，出入境人群是毒株国际间传播的重要媒介，因此，在出入境人群中进行HIV检测具有防止病毒传入传出和对国境安全把关的重要作用。我国出入境人群的HIV检出率呈逐年上升趋势，仅2006年上半年中国在1.26亿人次的出入境人员中查出HIV阳性者290人。本次研究中，以男性中青年和性接触感染为主。从不同职业人群的角度分析显示，HIV感染者中，其主要原因是离家远，时间长，缺乏正常的夫妻性行为，也有一小部分人从事性服务行业，不懂得自我保护，导致HIV的感染。
我国的HIV分子流行病学数据库正在逐步完善，但是其中出入境人群的资料和信息仍十分匮乏，分析出入境人员HIV-1毒株的gag基因序列特征能够从分子水平追踪病毒的传播来源和毒株的变异规律，进一步充实我国艾滋病病毒数据库，为国家制定艾滋病防治规划提供科学依据。我们对39例出入境人员HIV-1感染者进行了gag基因系统树分析，结果共存在8种HIV-1亚型，以C和CRF01_AE亚型居多，而且发现了我国较少见的瑞典A1亚型和西非的CRF02_AG亚型。图1 HIV-1gag区系统进化树分析 不同的亚型有其相应的主要传播方式，B/B’主要在经血传播的感染者中流行，而CRF08-BC和CRF-01AE则分别在吸毒人群和性乱人群中流行［7～11］。本次研究中A/E亚型毒株主要来自泰国，C亚型毒株主要来源于印度，CRF02_ AG亚型毒株来源于西非，CRF07_BC亚型的毒株主要是来自于我国云南边境和缅甸的人群。应有针对性地加强对这一人群的教育，保护中国出入境人员的身体健康，加大对出入境人员进行关于艾滋病知识的宣传教育，指出艾滋病对自身的危害性，以及感染上艾滋病后对家庭、事业和社会的影响力度，让每个出入境人员都了解HIV防治知识，让他们充分认识到在国外也要有良好的生活习惯。同时要加强对来自东南亚、南亚入境人员艾滋病的监测工作，避免艾滋病在国内的传播。
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作者单位：100013 北京,北京出入境检验检疫局