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【摘要】 目的 研究人类白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）DR等位基因多态性与浙江籍汉族原发性肝癌遗传易感性的关系，为寻找原发性肝癌的易感基因或保护基因提供线索。方法 应用聚合酶链反应-序列特异性引物技术对101例浙江籍原发性肝癌患者和111例正常健康对照者进行了HLA-DR等位基因检测，并结合临床资料进行比较分析。结果 原发性肝癌组HLA-DR15、DR13等位基因频率显著下降，其他等位基因在两组之间差异无显著性。结论 HLA-DR15、DR13等位基因可能是浙江籍汉族人群原发性肝癌的抵抗基因。
【关键词】 人类白细胞抗原; 原发性肝癌; 遗传易感性
The association of HLA-DR allele polymorphism with the genetic susceptibility to primary carcinoma of liver
HAO Bing, GAO Song, MENG Xue-qin.Key Laboratory of Combined Multi-Organ Transplantation, Ministry of Public Health, First Hospital Affiliated to Medical College of Zhejiang University, Hangzhou 310003,China
【Abstract】 Objective To assess the association of human leucocyte antigen (HLA)-DR allele with the genetic susceptibility to primary carcinoma of liver. Methods One hundred and one patients with primary carcinoma of liver in Zhejiang area were investigated for HLA-DR gene by polymerase chain reaction-sequence specific primers technique. The results were compared with those from 111 normal healthy people. Results The frequency of HLA-DR15, DR13 allele in patient group was significantly lower than that in control group. There was no obvious difference in the frequencies of other HLA-DR alleles between two groups. Conclusion HLA-DR15, DR13 allele is a resistance gene in patients with primary carcinoma of liver.
【Key words】 human leucocyte antigen; primary carcinoma of liver; genetic susceptibility
原发性肝癌(PCL)是临床上常见的严重危害人类健康的疾病。临床资料显示不同的原发性肝癌个体，临床表型各不一样，提示原发性肝癌与机体的免疫功能以及某些遗传因素有密切关系。HLA（human leucocyte antigen）是位于人6号染色体短臂上一群高度多态性的紧密连锁的基因群，它所编码的主要组织相容性抗原，与控制移植排斥反应，介导免疫应答。免疫调节及某些病理状态的产生密切相关。以往的研究认为HLA基因型的多态性可能与原发性肝癌的遗传易感性有关［1］。我们利用聚合酶链反应/序列特异性引物（polymerase chain reactian/sequence specific primer）技术通过对浙江地区原发性肝癌患者中HLA-DR基因多态性分析,以探讨HLA-DR与原发性肝癌遗传易感性的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 病例组为我院2005年11月～2007年7月浙江籍汉族原发性肝癌患者101例，男65例，女36例，平均年龄（54±8.7）岁，经B超、CT、肝穿刺活检或手术确诊。所有患者诊断均符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准［2］。正常对照组为111名健康献血员，是无血缘关系的随机人群，男80例，女31例，平均年龄（38±7.6）岁。无原发性心、肺、肾疾病及高血压病，肝酶谱正常，病毒标记物阴性。
1.2 标本采集 两组研究对象每个个体各抽取5ml静脉血，用ACD抗凝。以2000r/min离心10min，血细胞-20℃保存。
1.3 基因组DNA的抽提 用QIAamp Blood DNA快速提取试剂盒（QIAGEN公司），按试剂盒说明书，从外周静脉血淋巴细胞提取基因组DNA，溶于200～400μl TE中，-20℃保存备用。用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度，A260/A280为1.6～1.8。
1.4 PCR/SSP技术测定 采用Biotest DR，SSPtray试剂盒（广州永益生物技术有限公司）扩增HLA-DR等位基因DNA片段。PCR反应体系、循环条件、操作方法，按试剂盒操作说明书进行。PCR扩增结束后，用0.5×TBE作电泳液，150V电泳15min,放置紫外灯下观察、照相、分析、判断结果。
1.5 统计学方法 等位基因频率（检测样本数×2）用直接计数法计算，病例组与正常对照组间基因频率差异的统计学意义用r×c表χ2检验，如果四格表中有期望值＜5,用Fisher精确概率法计算P值,相对危险度(relative risk,RR)用Haldare修正公式计算。
2 结果
HLA-DR等位基因检测,原发性肝癌组HLA-DR8、DR11等位基因频率较正常对照组明显升高（DR8:14% VS 7.2%,RR=2.28 P=0.017）,(DR11:10% VS 4.5% RR=2.65 P=0.015)。原发性肝癌组HLA-DR15、DR13等位基因频率显著低于正常对照组（DR15:7.4% VS 17%,RR=0.34,P=0.001）,(DR13:7.2% VS 15%，RR=0.18 P=0.004)。 HLA-DR其他等位基因在两组之间差异无显著性，见表1。表1 原发性肝癌组及正常对照组HLA-DR等位基因频率（略）注:*P<0.01,＃P<0.05
3 讨论
原发性肝癌有家庭集聚现象，提示高发家庭成员体内可能存在导致癌变的内环境。HLA等位基因的多态性是决定机体免疫应答能力重要的遗传因素，其产物在不同水平参与和介导机体的抗原识别与提呈，决定不同个体对抗原免疫应答的差异，是目前已知人类最为复杂的多态性遗传系统。
有关HLA-DR与原发性肝癌关系的研究少见报道。我们的研究结果显示：在原发性肝癌组HLA-DR15、DR13等位基因频率显著低于正常对照组,提示HLA-DR15、DR13等位基因可能与原发性肝癌的抵抗有关,可能为原发性肝癌的保护基因。
以往的研究已经证实，乙型肝炎病毒（HBV）及丙型肝炎病毒（HCV）的感染是导致原发性肝癌的重要原因之一［3］。国外研究发现，HLA-DR13在HBV清除中发挥重要作用［4］;而且，HLA-DR13也与抗HCV感染有关［5,6］;程元桥等［7］发现HLA-DR15为乙肝后肝硬化的抵抗基因；提示HLA-DR13、DR15可能是通过病毒清除或者抑制病毒复制来发挥对机体的保护作用。
本研究结果表明特异性遗传背景可增加或降低人群患原发性肝癌的危险性,反映了原发性肝癌可能的遗传背景,这一结果将为今后研究原发性肝癌的发病机理和判断预后提供新的线索,并为原发性肝癌患者行肝移植提供理论依据。
【参考文献】
1 Ricci G, Colombo C, Ghiazza B,et al.HLA、B、C、DR and DQ expression and hepatoeellular carcinoma:study of 205 Italian subjects.Cancer Lett,1995,98(1):121-125.
2 中国抗癌协会肝癌专业委员会、原发性肝癌的临床诊断与分期标准.中华肝脏病杂志,2001,9(6):324-325.
3 Kitamura T,Watanabe S,Sato N,et al.Liver regeneration,liver cancers and cyclins.J Gastroenterol Hepatol,1998,13(1):S96-99.
4 Karan MA, Tascioglu NE, Ozturk AO, et al. The role of HLA antigens in chronic hepatitis B virus infection.J Pak Med Assoc,2002,52(7): 253-256.
5 Martinetti M, Pacati I, Cuccia M, et al. Hierarchy of baby-linked immunogenetic risk factors in the vertical transmission of hepatitis C virus.Int J Immunopathol Pharmacol,2006,19(5):369-378.
6 Bosi I, Ancora G, Mantovani W,et al.HLA DR13 and HCV vertical infection. Pediatr Res,2002,51(3):746-749.
7 程元桥，林菊生，黄丽红，等.人类白细胞抗原DRB1等位基因与乙肝后肝硬化遗传易感的研究.中华医学遗传学杂志,2003,20（3）：247-249.
作者单位：310003 浙江杭州，浙江大学医学院附属第一医院浙江省器官移植重点研究实验室