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【摘要】 目的 研究短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠血脂的影响。方法 建立MSG大鼠模型：出生d1的SD大鼠，雌雄兼用，皮下注射谷氨酸钠（MSG）3mg/（g·d），连续5天，正常对照组皮下注射等容积生理盐水。3月龄时将肥胖动物随机分5组：分别皮下注射rhCNTF300μg/（kg·d）（高剂量组）、100μg/（kg·d）（中剂量组）、30μg/（kg·d）（低剂量组），西布曲明灌胃8mg/（kg·d）（阳性对照组），稀释液1.0ml/(kg·d)（肥胖对照组）；模型组和对照组均给予生理盐水1ml/（kg·d)，连续给药10天。末次给药后24h，同时动物禁食过夜后，在水合氯醛麻醉下，测体重、身长，计算LI；断头后取腹部脂肪称重、计算脂肪系数（脂肪重/体重）；腹主动脉取血离心后得血清测总胆固醇（胆固醇氧化酶-过氧化物酶法）、甘油三酯（GPO-PAP法）、高密度脂蛋白（沉淀法）、血糖（GOD-PAP法）和血清胰岛素（放射免疫测定法）水平；断头后取腹部脂肪称重、计算脂肪系数（脂肪重/体重）。结果 ⑴ 造模：正常大鼠（189.40±38.72）g，谷氨酸钠肥胖大鼠平均体重（246.72±36.67）g，（P<0.001）；LI分别为289.27±9.05和304.42±9.64（P<0.001）。说明造模成功。 ⑵ 药物实验结果：高、中剂量给药组体重、LI、脂肪系数、血总胆固醇、甘油三酯、血糖明显下降达，到统计学要求的显著性；胰岛素水平也有所下降，但未达到统计学要求的显著性（P＞0.05）。结论 rhCNTF 30～300μg/（kg·d)皮下注射连续用药10天，对谷氨酸钠肥胖大鼠具有明显的减肥降脂作用，可能对2型糖尿病肥胖有效。
【关键词】 重组人睫状神经因子；谷氨酸钠肥胖大鼠；降脂作用；降血糖作用
Antilipemic effect of recombinant human ciliary neurotrophic factor on obesity rats induced by monosodium glutamate
GUO Shu-fang, HAN Guo-zhu, LI Wei-ping, et al. Department of pharmacology, Dalian Railway Hygiene School, Dalian 116001,China
【Abstract】 Objective To investigate the short-term antilipemic effect of recombinant human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF) on obesity rats induced by monosodium glutamate (MSG). Methods Obesity models were established by hypodermic injection of MSG to newborn rats. rhCNTF was used at 30～300μg·kg s.c. once a day for 10 days. The body weight and food intake were monitored everyday. After final administration, rats were narcotized with choral hydrate, then the body length and weight were measured to calculate Lee’s index. Blood was sampled through abdominal aorta to assay the serum levels of glucose and lipids. Fat around kidney and genitals and in abdominal cavity was collected for calculation of fat index. Results The body weight and Lee’s index of MSG-rats were significantly higher than those of normal rats, indicating that MSG-Obesity model was established successfully. The short-term administration of high and middle dose of rhCNTF resulted in a significant and dose-dependent reduction of body weight, Lee’s index, fat index, serum triglyceride (TG) and tatal cholesterol (TC), as opposed to profoundly increased high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) in comparison with obese saline-treated control. It also produced a significant hypoglycemic activity. Conclusion rhCNTF has a significant and dose-dependent antilipemic effect in MSG-rats. This agent is rapid in onset of action. Along with the antilipemic effect, rhCNTF also produces a significant hypoglycemic activity.
【Key words】 Recombinant human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF); obesity rats induced by MSG; antilipemic effect; hypoglycemic activity
睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophic factor,CNTF）最初是从鸡的睫状体中提取出来的，是一种由200个氨基酸组成的分子量23000的蛋白多肽，因可维持鸡副交感神经节的存活而得名［1，2］。因在治疗肌侧索硬化症（ALS）过程中显示出明显的减肥效应而受到医务工作者的重视。rhCNTF是由美国Regeneron公司开发的第二代基因工程新药。是全世界第一个进入临床检验的基因工程神经营养因子药物，在促进运动神经元发育并防止受损运动神经元的退变方面具有独特的作用。动物实验已证实该药对肥胖动物模型、2型糖尿病肥胖动物模型有效［3］，具有显著的降血糖、降血脂作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物 rhCNTF 粉针剂：由上海万兴生物制药有限公司提供。规格：2mg/支，纯度：98.6%，批号：20031001。盐酸西布曲明粉剂，购自南京长澳制药有限公司，批号：030102，纯度：99.7%。
1.1.2 受试动物 SD母仔大鼠，由大连医科大学动物中心提供。
1.1.3 饲料
1.1.3.1 基础饲料 大麦粉20%，脱水菜10%，豆粉20%，酵母1%，骨粉5%，麸粉16%，玉米粉16%，鱼粉10%，食盐2%（由沈阳市于洪区动物实验饲料厂生产）。
1.1.3.2 营养饲料 由本科研组自行配制，每100g基础饲料中添加奶粉10g,猪油10g,鸡蛋1只，新鲜黄豆芽250g，混匀后蒸20min，加浓鱼肝油10滴（含维生素A 17000U，维生素D 1700U）拌匀制成饼状，置于70℃烤箱烘24h即成。
1.1.4 仪器 电子天平（上海精密科学仪器有限公司，FA/JA型电子天平，精确度0.0000g），LD5-2A离心机（北京医用离心机厂制造），754分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），恒温水浴箱（北京市医疗设备总厂）。
1.1.5 试剂 总胆固醇试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司,批号：20040101；高密度脂蛋白试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司，批号：20031101；血糖试剂盒均购自上海荣盛生物技术有限公司361500，甘油三酯试剂盒购自浙江东瓯生物工程有限公司，批号：00031；125I-胰岛素放射免疫分析药盒购自中国原子能科学研究院。
1.2 方法
1.2.1 谷氨酸钠大鼠模型的建立 出生d1的SD大鼠，雌雄兼用，皮下注射谷氨酸钠（MSG）2mg/（kg·d)，连续5天，正常对照组皮下注射等容积生理盐水。断乳后分笼饲养，模型组给予营养饲料，正常组给予基础饲料。
1.2.2 分组与给药 模型建立后，正常组随机取10只分为1组，模型大鼠50只随机分成5组，每组大鼠10只，雌雄各半，分别为:（1） 正常对照组：颈背部皮下注射（SC）稀释液1.0ml/（kg·d);（2） 肥胖对照组：颈背部皮下注射（SC）稀释液1.0ml/（kg·d);（3） 高剂量组：颈背部皮下注射（SC）rhCNTF 300μg/（kg·d);（4） 中剂量组：颈背部皮下注射（SC）rhCNTF 100μg/（kg·d);（5） 低剂量组：颈背部皮下注射（SC）rhCNTF 30μg/（kg·d);（6） 阳性对照组：灌胃（ig）盐酸西布曲明8mg/（kg·d)。
1.2.3 实验步骤及测定指标 整个实验过程中，动物房温度控制在（21±1）℃，湿度控制在45%～55%之间。造模期间每天早8：30通风换气，9：00称取动物的投食量及剩食量及撒食量，计算动物每日进食量。每3天称各大鼠体重1次。3月龄时将肥胖动物随机分5组：分别皮下注射rhCNTF300μg/（kg·d)（高剂量组）、100μg/（kg·d)（中剂量组）、30μg/（kg·d)（低剂量组）；西布曲明灌胃8mg/（kg·d)（阳性对照组）；模型组和对照组均给予生理盐水1ml/（kg·d)。连续给药10天。末次给药后24h，同时动物禁食过夜后，在水合氯醛麻醉下，测体重、身长，计算Lee’s指数；腹主动脉取血，离心(3000r/min×10min)后得血清测总胆固醇（胆固醇氧化酶-过氧化物酶法）、甘油三酯（GPO-PAP法）、高密度脂蛋白（沉淀法）、血糖（GOD-PAP法）和血清胰岛素（放射免疫测定法）水平；断头后取腹部脂肪（腹膜后、肾周、腹股沟周围）称重、计算脂肪系数（脂肪重/体重）。
整个实验过程中对动物的自发活动、体征及有无腹泻等情况进行观察，并记录。各测得指标均以SPSS11.0统计软件分析。
2 结果
2.1 谷氨酸钠肥胖大鼠模型的建立 给药前正常大鼠(189.40±38.72)g，模型组肥胖大鼠平均体重(246.72±36.67)g，（P<0.001）；LI分别为304.42±9.64和289.27±9.05（P<0.001）。说明谷氨酸钠肥胖大鼠模型建立成功。
2.2 rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠减肥作用
2.2.1 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠的体重的影响 给药后短周期给药组体重：肥胖对照组（260.2±38.3）g，高剂量组为（200.4±26.3）g（P<0.01 vs 肥胖组）,中剂量组为(215.4±30.8)g（P<0.05 vs 肥胖组）。连续应用rhCNTF 10天，谷氨酸钠肥胖大鼠的体重出现了明显下降的趋势，作用呈剂量依赖性。如图1所示。
2.2.2 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠进食量的影响 短期应用rhCNTF后大鼠进食量明显减少，作用具有明显的量效关系和时效关系。连续给药前4～5天进食量呈持续下降状态；接着四天左右进食量变化不大，以后呈稳定缓慢回升状态。具体如图2所示。
2.2.3 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠Lee’s指数和脂肪系数的影响 短期应用rhCNTF 后各组大鼠测得Lee’s指数 ：肥胖对照组323.7±9.2、高剂量组298.4±14.5（P<0.01 vs肥胖对照组），中剂量组305.2±8.2（P<0.01 vs肥胖对照组），低剂量组313.5±11.3（P<0.05 vs肥胖对照组）；脂肪系数： 肥胖对照组6.05±1.65，高剂量组3.74±1.91（P﹤0.01），中剂量组4.54±1.51（P﹤0.05）；肥胖对照组的Lee’s指数和脂肪系数均明显大于正常对照（P﹤0.01），应用rhCNTF后Lee’s指数和脂肪系数均明显减小，呈剂量依赖性。如表1所示。表1 短周期应用rhCNTF后体重、李氏指数、脂肪系数图表（略）注：与正常对照组比较，##P<0.01；与肥胖对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.2.4 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠血脂的影响 肥胖模型组的胆固醇、甘油三酯明显高于正常对照组（P<0.01）；而高密度脂蛋白则明显低于正常对照组（P<0.01）。短期应用rhCNTF后模型组的胆固醇、甘油三酯明显降低，与肥胖对照组比差异有显著性（P<0.01或P<0.05）；而高密度脂蛋白则明显升高。如表2所示。表2 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠血脂的影响 （略）注：与正常对照组比较，##P<0.01；与肥胖对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
2.2.5 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠血糖、胰岛素的影响 谷氨酸钠肥胖大鼠胰岛素抵抗、胰岛素水平、血糖值均明显高于正常对照组（P<0.01），应用rhCNTF后血糖值下降。高剂量组为11.09±1.28，中剂量组为8.95±1.00，与肥胖对照组比差异有显著性（P<0.01）。胰岛素水平亦出现下降现象，但未能达到统计学上的显著性（P＞0.05）。如表3所示。表3 短期应用rhCNTF对谷氨酸钠肥胖大鼠血糖、胰岛素的影响 （略）注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与肥胖对照组比较，**P<0.01
2.3 其他 在实验过程中各大鼠大便性状正常，未观察到粪便变稀；未见大鼠出现毛色晦暗、腹泻、行为异常等不良反应。
3 讨论
谷氨酸钠肥胖大鼠是下丘脑性肥胖，是由于大剂量谷氨酸钠选择性地破坏了大鼠下丘脑腹内侧核的饱食中枢,致使大鼠进食量增加,而出现腹型肥胖。另外，我们也注意到模型组的动物在整个实验过程中自发活动显著减少,这说明交感神经处于抑制状态，这对于导致大鼠肥胖症的发生也有帮助［4］。下丘脑肥胖模型伴有的显著特征为胰岛素抵抗，高胰岛素血症［5，6］。肥胖者脂肪细胞的增大能导致胰岛素作用受损，但其确切机制不明。近年来国外的研究发现，脂肪细胞不仅是被动的能量储存器，而且是内分泌系统的活跃组成部分，能分泌多种激素、细胞因子和其他蛋白物质，共同影响机体的能量平衡，如瘦素（leptin）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、纤溶酶原激活物抑制因子-1、补体D（adipsin）、脂肪细胞补体相关蛋白（adiponectin）等。2001年发现的脂肪细胞分泌的胰岛素抵抗因子（resistin）被认为是肥胖与胰岛素抵抗的重要中间环节［7］。高胰岛素血症的产生主要是由于下丘脑内侧核破坏，使迷走神经处于受刺激状态，刺激胰腺分泌胰岛素增加。胰岛素是促脂肪生成激素，能促进脂肪前体细胞分化，所以体内胰岛素水平升高进一步加重肥胖，造成恶性循环［8］。另外又有报道，破坏腹内侧核会使交感神经处于一种抑制状态，交感神经因子也是高胰岛素血症发病的重要因素之一。下丘脑性肥胖虽然与人类的肥胖症不尽相同，但研究表明人类的重度肥胖症类似于动物丘脑下部性肥胖［9，10］。
rhCNTF是由美国Regeneron公司开发的第二代基因工程新药，实验结果显示：rhCNTF短期用药（连续用药10天）后各项检测指标均支持药物的减肥降脂作用，表现为体重、Lee’s指数和脂肪系数、胆固醇、甘油三酯、血糖均明显降低，同时高密度脂蛋白升高，统计学上达到了显著性（P﹤0.01或P﹤0.05）。胰岛素抵抗缓解，血清胰岛素水平降低，但未能达到统计学上的显著性。原因可能与测得值标准差较大有关,我们应用的125I-胰岛素放射免疫分析药盒为用于人类的，如果是大白鼠专用药盒可能结果会较理想。这一作用提示，rhCNTF可能对2型糖尿病肥胖有效。
【参考文献】
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4 Terutake NAKAGAWA, Kiyoharu UKAI, Tadashi OHYAMA, et al． Effects of Chronic Administration of Sibutramine on Body Weight, Food Intake and Motor Activity in Neonatally Monosodium Glutamate-Treated Obese Female Rats:Relationship of Antiobesity Effect with Monoamines． Exp Anim,2000,49(4)：239-249.
5 Hirata AE, Andrade IS, Vaskevicius P， et al．Monosodium glutamate (MSG)-obese rats develop glucose intolerance and insulin resistance and insulin resistance to peripheral glucose uptake．Braz J Med Biol Res, 1997, 30(5):671-674.
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10 钱伯初． 肥胖动物模型的制备原理和方法．中国药理学通报，1993，9（1）：75.
作者单位：116001 辽宁大连，大连铁路卫生学校药理教研室