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【摘要】 目的 对100件水产品涂抹标本进行检测，分析是否存在霍乱弧菌感染的可能性。方法 将PCR技术和常规方法结合，样品先进行PCR检测，阳性样品再常规分离和鉴定。结果 从100件水产品涂抹标本中检出一株具流行性的O139群霍乱弧菌。结论 水产品中有霍乱弧菌存在，易受到感染，存在霍乱流行隐患。
【关键词】 霍乱弧菌；PCR
霍乱是人类烈性肠道传染病，迄今为止已发生7次世界大流行。主要的临床表现为剧烈吐血，严重脱水甚至酸中毒，给人民带来极大危害。霍乱是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一。主要由O1群和O139群霍乱弧菌引起［1］。近年来，霍乱弧菌的相关报道日渐增多，引起广泛关注［2］。而我区也于2007年从涂抹品标本（白水鱼）中检出一株具流行性的O139群霍乱弧菌，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 由我区霍乱监测点采集水产品涂抹标本100件，送至我中心进行霍乱弧菌检测。
1.1.2 培养基 碱性蛋白胨水增菌液、链霉素月桂基硫酸钠亚碲酸钾琼脂（简称双洗）、生化反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供。均在有效期内使用。
1.1.3 诊断血清 霍乱弧菌混合多价诊断血清、小川、稻叶、O1、O139群诊断血清由上海市疾病预防控制中心提供。均在有效期内使用。
1.1.4 PCR扩增仪 Techne Flexigene；全自动数码凝胶成像系统Tanon GIS-2010。
1.1.5 PCR试剂盒 霍乱弧菌O1血清群、O139血清群、肠毒素基因（CTX）PCR检测试剂由上海健伊生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细菌的增菌分离培养鉴定 按《霍乱防治手册》第五版进行。将涂抹棉拭子放入9ml碱性蛋白胨水中增菌37℃培养6h后，用双洗平板做分离培养。挑取双洗平板上可疑菌落做血清凝集和生化反应。
1.2.2 PCR检测方法 取增菌液500μl,12000rpm/min离心5min,弃上清液，加100ulDNA提取液入沉淀中，振荡混匀，置100℃水浴加热10min,12000rpm/min离心5min，保留上清液待用。取4μl上清液加入26μlPCR反应液中,同时做阳性对照。振荡混匀，将PCR反应管放入PCR扩增仪中。首先预变性94℃5min，然后按94℃30s、55℃30s、72℃60s循环35次，最后72℃延长5min。取15μl的扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中进行电泳，然后用凝胶成像系统进行分析。
2 结果
2.1 PCR检测结果 用PCR法检测100件涂抹品标本，其中白水鱼身标本结果显示为O139群霍乱弧菌。
2.2 常规法检测结果 从双洗平板上可疑菌落进行鉴定，检出1株O139群霍乱弧菌。
2.2.1 形态与染色 O139群霍乱弧菌为革兰阴性、无芽孢、短小稍弯曲的杆菌。
2.2.2 培养特性 该菌在碱性蛋白胨水经37℃培养6h后即产生菌膜，分离至双洗平板经37℃培养24h后形成光滑、圆整、中心带浅褐色、略为浑浊的菌落。
2.2.3 生化特性 见表1。表1 生化反应结果
2.2.4 血清凝集试验 分离的可疑菌株分别与霍乱“O1+O139”混合多价和“O1”多价、“O139”多价诊断血清进行玻片凝集试验。结果“O1+O139”混合多价及“O139”多价血清凝集阳性，盐水对照为阴性。
2.2.5 山梨醇发酵试验及毒力基因试验结果 将菌株进行毒力基因（CTX）PCR检测及山梨醇发酵试验，结果毒力基因（CTX）为阳性。山梨醇迟发酵。同时将菌株送市疾病预防控制中心进行鉴定，确认该菌为10 O139弧菌，具有流行性。
3 讨论
霍乱弧菌的分布比较广泛，为散发性，且有季节性。霍乱的流行性和季节性取决于产毒素霍乱弧菌在水体不同的微生物环境存活情况。而此次从外环境中检出具有流行性的霍乱弧菌表明我区的水产品已受到霍乱弧菌污染，存在霍乱流行隐患，对人民的健康构成威胁。提醒我们相关部门须高度重视霍乱流行病学监测，及时消毒。采取有效的预防措施，加强监督和管理，预防火力的暴发流行。
霍乱弧菌生长繁殖速度很快，在碱性蛋白胨水中生长6h后，液体表面即开始形成菌膜。取此增菌液先进行PCR检测，可为霍乱弧菌的检出提供方向，缩小重点范围，同时也防止遗漏菌落形态不典型的菌株，并节约工作时间，提高工作效率。
【参考文献】
1 高守一．霍乱防治手册，第5版.卫生部疾病控制司,1999.
2 曾晓军,黄砜,周一平,等.郴州市海、水产品霍乱弧菌污染状况监测．实用预防医学，2006,6(3):619.
作者单位：上海，上海市奉贤区疾病预防控制中心