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【摘要】 目的 建立测定洗必泰血中浓度的高效液相色谱法。方法 血液样品提取为Bakerbond SPE C18固相提取。内标为氯丙嗪。分析柱为Capcell Pak C18 (250mm×4.6mm i.d.,5μm) 反相色谱柱，流动相为 乙腈：水(40:60)，添加适当离子对试剂，流速1ml/min，检测波长260nm，柱温40℃。结果 洗必泰含量在0.05～2.0μg/g范围内，血中浓度与峰面积比有良好的线性关系（r=0.999），血中回收率为72%～84%;日内精密度CV≤9%，日间精密度CV≤10%。结论 本方法简单、可靠、准确，可用于测定血中洗必泰的浓度。
【关键词】 洗必泰；固相萃取法；高效液相色谱法
Determination of chlorhexidine in rat blood by high performance liquid chromatography with solid phase extraction
XUE Yu-ying, TANG Meng, HIEDA Yoko, et al. School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China
【Abstract】 Objective To establish a method for the determination of chlorhexidine in rat blood by high performance liquid chromatography (HPLC) with solid phase extraction (SPE). Methods Blood samples, spiked with chlorpromazine as an internal standard, were fortified with sodium acetate buffer and purified with Bakerbond C18 SPE column. The HPLC was performed on a Capcell Pak C18 MG column (250mm 4.6 mm, 5μm) by using acetonitrile-water (40:60) as mobile phase.The flow rate was 1 ml/min ,detection wave length was 260 nm and column temperature was 40℃. A consisting of 0.05% trifluoroacetic acid, 0.05% heptafluorobutyric acid, and 0.1% triethylamine was employed. Results The assay was linear over the range of 0.05～2.0μg/g and the recoveries in blood ranged from 72 % to 84 %, the intra- and interday precision expressed as coefficient of variation was less than 9% and 10%, respectively. Conclusion The method is simple, sensitive and reliable for determination of chlorhexidine in practical biological samples.
【Key words】 chlorhexidine; solid phase extraction; high performance liquid chromatography
洗必泰在临床上作为常用的消毒防腐剂，主要用于器械、皮肤、黏膜的消毒，它具有抗菌范围广、效力强、成本低的特点，其用途正日益扩大。近年已有用于妇科、皮肤科、口腔科和内科的报道，甚至用于饮用水的消毒，还被作为抗菌剂添加到各种日常清洗剂和化妆品中。由于这些产品随手可得，常常会造成意外事故。误饮造成中毒甚至死亡事故时有发生，多年来美国、欧洲、日本都有相应的报道［1～3］。在我国随着人们生活水平的不断提高，人们对生活环境的卫生要求也越来越高，杀菌消毒剂的使用呈明显上升趋势。因使用不当或误服引起的中毒事故也时有报道［4,5］。由于消毒剂通常只是作为外用药开发的，缺少对其吸收后的体内毒性研究，加上其独特的理化性质，至今未见有在血液中定量的研究报道。本文建立了血中洗必泰的含量测定方法，采用固相萃取法纯化血液样品，用高效液相色谱法分离定量，并且利用建立的方法测定了大鼠口服洗必泰消毒液后的血中和组织浓度，可为临床中毒抢救提供相关参考。
1 材料与方法
1.1 试药 洗必泰标准品购自Sigma 公司（美国）；洗必泰消毒液商品(Maskin)， 购于日本丸石制药公司，为含洗必泰20%的水溶液， Maskin是日本最常见的消毒剂之一，归属非处方药物；内标氯丙嗪购自ICN Biomedicals公司（美国）；固相萃取小柱为美国J.T.Baker公司的Bakerbond SPE C18柱（规格3ml, 500mg）；高效液相色谱用试剂为色谱纯，水为自制超纯水（法国Millipore公司）；其他试剂为分析纯。
1.2 仪器 固相萃取装置为Sep-Pak Waters Vacuum Manifold (Millipore)；高效液相色谱仪为岛津SCL-10A系统, 配有SCL-10Avp系统控制器，LC-10ADvp和LC-10AD双泵，SIL-10ADvp自动进样器，CTO-2A柱温箱，Waters 2487型UV检测器及Hitachi D-7500型数据处理器；色谱柱为Capcell Pak C18 (250mm × 4.6mm i.d.,5μm) (Shiseido)反相柱；日本Waken GE100超声匀浆仪；日立高速离心机。
1．3 色谱条件 流动相由乙腈-水以(40:60, v/v)混合组成，添加0.05%的三氟乙酸和七氟丁酸以及0.1%的三乙胺，充分混匀。流动相在临用前经超声脱气处理。流速为1ml/min，紫外检测波长为260nm，柱温为40℃。
1．4 标准溶液配制
1．4．1 氯苄烷铵标准液的配制 精密称取标准品适量，以甲醇溶解并定容，制得浓度为1mg/ml 的洗必泰标准储备液。于冰箱中4℃保存备用。
1．4．2 内标液的配制 精密称取内标适量，以甲醇溶解并定容，制得浓度为1mg/ml 的内标储备液。于冰箱中4℃保存备用。
洗必泰及内标储备液在冰箱中4℃储存条件下至少稳定半年。实验时再稀释至所需浓度。
1．5 固相萃取步骤
1．5．1 固相柱活化 Bakerbond SPE柱分别用3ml 甲醇和3ml pH5.0的醋酸缓冲液活化，保持液面正好位于柱床之上，避免柱床干燥。
1．5．2 样品预处理 取大鼠血液或充分剪碎的大鼠组织0.1～1.0 g，用超声匀浆仪匀浆处理1min后，加入超纯水、内标（1.0μg）和1N盐酸溶液，充分振荡15min，2500rpm、20min离心后，取上清液加入pH5.0的醋酸缓冲液，于高速离心机4℃条件下18000r/min离心30min，取上清液加入到经活化的固相提取柱上。
1．5．3 固相柱淋洗 待样品液完全流入固相柱后，先用超纯水淋洗3次，然后用甲醇淋洗3次，除去内源性蛋白质干扰物，再用乙酸乙酯淋洗3次，除去内源性脂肪干扰物，弃去淋洗液，抽干固相柱以除尽残留溶剂。
1．5．4 样品洗脱 吸附在固相柱上的洗必泰和内标用含有0.01%氯化铵的甲醇-乙酸乙酯（1：1, v/v）混合液洗脱，收集洗脱液。
洗脱液以氮气吹干，残渣溶于150μl流动相中，以0.2μm 注射式过滤器滤过后，取10μl 进样，记录色谱图，以洗必泰峰面积和内标峰面积之比定量。
1．6 血中标准曲线制备 取大鼠血液样品0.5ml，精密加入不同浓度的洗必泰标准溶液和内标液，使在血中的浓度范围为0.05～2.0μg/g，按照上述固相萃取步骤操作，经高效液相色谱分析。
1．7 回收率和精密度 取大鼠血液样品0.5ml，精密加入洗必泰标准溶液和内标液，按照上述固相萃取步骤操作，经高效液相色谱分析。同时以相同浓度的标准溶液和内标液，按照相同步骤操作并进行高效液相分析，以血液样品和标准溶液中相应的峰面积之比分别计算洗必泰和内标在大鼠血中的回收率。将峰面积之比代入标准曲线计算含量，比较测得值与加入值，并计算日内精密度，以每天1次，连续6天测定的洗必泰含量计算日间精密度。
2 结果
2．1 色谱行为 见图1。如图1所示，在本方法的固相萃取处理和色谱条件下，血中或组织内源性杂质不影响洗必泰与内标的分离， 洗必泰和内标的保留时间分别为10min和20min，相互之间分离完全，峰形良好，无杂质峰干扰。A：洗必泰标准品和内标；B：洗必泰消毒剂商品Maskin；C：大鼠空白血液；D：大鼠血液样品。CHX：洗必泰； IS：内标
图1 高效液相色谱图
2．2 标准曲线 见图2。图2为洗必泰血中标准曲线，在含量为0.05～2.0μg/g范围内显示良好的线性关系，回归方程为Y=0.637X+0.027，r=0.999(n=3)。当设定信噪比>10时，方法的最低检出限为5ng。图2 洗必泰血中标准曲线
2．3 回收率和精密度 见表1、表2。表1显示洗必泰在血中的回收率；表2显示此方法的日内和日间精密度。结果表明，经固相萃取纯化和高效液相色谱分析，洗必泰和内标在血中均有较高的回收率，且此方法的精密度和重现性良好。表1 洗必泰和内标在大鼠血中的回收率 （n=6）表2 洗必泰在大鼠血中的日内和日间精密度
2．4 大鼠口服后血中和组织浓度 SD雄性大鼠，给药前夜禁食，灌胃给予2.5ml洗必泰消毒剂Maskin，24h处死，收集血液及肺、肝、肾组织样品，测定其中的洗必泰含量。结果见表3，大鼠口服洗必泰后，组织中的浓度明显高于血中浓度，24h时肺、肾仍有较高的浓度。图3为大鼠肾高效液相色谱图，本分析方法可较好的用于血液和组织样品中洗必泰的测定。表3 大鼠口服洗必泰消毒剂后血中及组织浓度
3 结论
本文建立了大鼠血中洗必泰浓度的测定方法。选用Bakerbond SPE C18固相萃取小柱，通过在洗脱液中添加微量氯化铵，可较好的将洗必泰洗脱，回收率良好。在本文设定的色谱条件下，血液及组织中的内源性杂质对测定没有干扰，主峰与内标分离良好。本法操作简便，灵敏度高。
作为外用消毒剂被广泛使用的洗必泰具有强烈的细胞毒作用，并且因其具有的表面活性剂样性质而对生物膜具有严重的破坏性。其独特的理化性质给生物样本中的测定带来难度。本文采用固相萃取和高效液相色谱联用的方法测定血中及组织中洗必泰的浓度，方法灵敏，操作简单快速。可适用于洗必泰毒物动力学的研究及临床中毒检测。
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作者单位：1 210009 江苏南京，东南大学公共卫生学院2 6938501 日本岛根，日本岛根大学医学部（Δ通讯作者）