5-羟色胺6受体基因多态性与阿尔茨海默病的关联性分析

【摘要】  目的 探讨5-羟色胺6受体（5-HTR6）基因多态性与阿尔茨海默病(AD)的关联性。方法 应用多聚酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测技术,在80例AD患者和85例健康老年人中观察5-HT6受体基因多态性的分布，并对其与AD之间的关系进行探讨。 结果 AD组5-HT6受体基因C/T基因型明显高于对照组，两组间差异有显著性（χ2=4.529，P=0.033)，C/T基因型与AD呈显著正相关（OR=2.084，95%CI=1.054～4.123）；将所有受试者经APOEε4分层，结果APOEε4组与非APOEε4组未发现显著差别。结论 5-HT6受体基因多态性C/T基因型与AD相关联，且可能是AD的一种独立危险因素。

【关键词】  阿尔茨海默病； 5-羟色胺6受体基因；载脂蛋白E基因；多态性；关联

 An Association analysis of 5-HT6 receptor gene polymorphism with Alzheimer's disease

    ZHANG Sheng-lin, HE Wen-jing, YANG Xiao-juan. Department of Geratology, The First Hospital Affiliated to Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the association between 5-hydroxytryptamine 6 (5-HT6) receptor gene polymorphism and Alzheimer's disease (AD) in Chinese. Methods  The genotypes and allelic frequencies of the 5-HT6 receptor gene were examined with polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism techniques (PCR- RFLP) in 80 patients with Alzheimer's disease and 85 unrelated healthy controls.Results  The C/T genotype of the 5-HT6 receptor gene was significantly more prevalent in the AD group than that in the control group (χ2=4.529 ，P=0.033). The C/T genotype had significant positive correlation with AD (OR=2.084，95%CI=1.054～4.123).There were no statistical differences of allele and genotype frequencies in cases and controls when all samples were divided into two subgroups by APOEε4 status.Conclusion  The 267C/T polymorphism of 5-HT6 receptor gene is found to be associated with Alzheimer's disease, and possibly involved in the susceptibility to AD as an APOEε4-allele independent risk factor.

    【Key words】  Alzheimer's disease; 5-HT6 receptor gene; APOE gene; polymorphism; association

    　研究表明，载脂蛋白E (Apoe)基因是散发性阿尔茨海默病(sporadic Alzheimer disease, SAD)的易患基因，但并非所有AD均可归因于ApoE基因, 因而可能存在其他的遗传因素在AD的病因学中起作用。5-HT是中枢神经系统中重要的神经递质，与大脑的认知功能，尤其与学习、记忆等高级功能存在联系。5-HT6受体(5-HTR6)分布于许多脑区，如纹状体、嗅球、大脑皮层、海马等, 其mRNA在额叶的嗅球和边缘区也具有较高的浓度，而大脑这些结构与近期记忆有关，这就提示我们，5-HTR6基因有可能参与了AD的病理过程，其变异可能成为阿尔茨海默病的危险遗传因素。为验证该基因在AD的病因学中的作用并寻找新的遗传标记，我们采用关联分析的方法, 对AD患者的5-HTR6基因多态性进行了研究。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    1.1.1  AD组  80例，男 50例，女30例，平均年龄（74.448±5.657）岁，均为2004年7月—2006年6月山西医科大学附属第一医院门诊及住院病人，全部病例应用简易精神状态检查量表（mini-mental state examination, MMSE）, 日常生活活动能力量表（activities of daily living, ADL），初筛出存在痴呆，Hachinski缺血指数＜4分排除血管性痴呆, 哈密尔顿抑郁量表(HAMD)评分＜8分排除抑郁状态，根据美国神经病学、语言障碍和卒中－老年性痴呆和相关疾病学会（NINCDS-ADRDA）的临床诊断标准诊断为临床很可能AD，所有研究对象均经过影像学头颅CT或MRI检查。排除卒中、肿瘤、脑积水、PD及Pick等所致的痴呆，排除曾有精神病史患者。

    1.1.2  对照组  85例，男 48例，女37例，平均年龄（72.329±9.899）岁，均为年龄、性别、文化程度与AD组相匹配、体检健康的老年人。

    以上研究对象均为山西汉族人，随机选择，无血缘关系。

    1.2  研究方法

    1.2.1  基因组DNA提取  抽取静脉血2ml，EDTA抗凝，采用低渗溶血，常规酚-氯仿法提取白细胞基因组DNA。

    1.2.2  5-HT6受体基因多态性检测  5-HT6受体基因的扩增采用聚合酶链反应(PCR)。引物序列为：5'-AACTTCTTCCTGGTGTCGCTCTTC-3' 和 5'-ATGAGCAGGTAGCGGTCCAGGC-3' ［1］。PCR反应参数为：94℃ 5min，30个循环(94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s)， 72℃5min。取PCR产物10μl，加10URsaI内切酶，37℃酶切过夜。2％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。结果显示复等位基因多态性，若为267C等位基因，则200bp的PCR产物被酶切成118bp和82bp两个片断；如果是267T等位基因，则不被酶切，即仍为200bp。根据电泳带型确定基因型。载脂蛋白E(APOE)基因型检测参照文献［2］。

    1.3  统计学处理  数据采用SPSS12.0软件进行统计学处理。等位基因和基因型频率分布的差异采用χ2检验，通过比值比(OR)的计算对AD与5-HT6受体基因各等位基因及基因型进行关联分析。

    2  结果

    2.1  5-HT6受体基因多态性与AD的关联分析  χ2检验结果表明，两组间各基因型分布总体比较其差异有显著性（P<0.05），AD组5-HT6受体基因的C/T基因型频率分布明显高于对照组(χ2=4.529, P=0.033)；关联分析结果显示，5-HT6受体基因的C/T基因型与AD呈显著正相关（OR=2.084，95%CI=1.054～4.123）（见表1）。表1  5-HT6受体基因多态性的分布 注：括号内数据为频率值(%)  χ2检验，与对照组比较，*P<0.05，C/T基因型OR=2.084，95%CI=1.054～4.123

    2.2  5-HT6受体基因多态性与Apoe基因   按是否含APOEε4等位基因将各组研究对象分为APOEε4型和非APOEε4型两组，并对AD与5-HT6受体基因各等位基因和基因型进行关联分析。结果表明，伴或不伴有APOEε4等位基因组5-HTR6各基因型及等位基因分布差异均无显著性（见表2）。表明5-HTR6基因和APOEε4等位基因不具有协同作用。表2  伴或不伴APOEε4等位基因的人群中5-HT6受体基因多态性的分布注：括号内数据为频率值(%)   χ2检验，与对照组比较，P>0.05

    3  讨论

    人类的5-HT6受体(5-HTR6)基因定位于第1号染色体长臂35、36区域(1p35p36)，其cDNA开放阅读框全长1320bp，编码440个氨基酸，研究发现它的cDNA267bp处存在碱基置换(T→C),提示存在多态性。为验证5-HTR6基因在AD的病因学中的作用，不同的研究组进行了相关探讨。Tsai等（1999）［3］在中国台湾人群中的相关研究发现267C等位基因在阿尔茨海默病组有显著增高趋势，首次提出：5-HTR6基因的C267等位基因与AD呈正相关。本实验在山西地区汉族人群中通过对5-HT6受体基因多态性的检测，结果发现5-HTR6基因多态性的C/T基因型的分布在晚发性阿尔茨海默病与对照组之间差异有显著性，存在相关性，将所有受试者经APOEε4分层后，结果APOEε4与非APOEε4组其各基因型及等位基因分布均未发现显著差别。表明5-HTR6基因与APOEε4等位基因无相互作用。故得出结论：5-HTR6基因多态性的C/T基因型与晚发性阿尔茨海默病呈正相关,且可能是一种独立危险因素。这与最近Rui Kan等［4］在105例中国内地人群中晚发性阿尔茨海默病患者中的研究结果相一致。然而对于该研究至今也没有统一的结论，J Thome等［5］在德国人群中的研究则显示：AD组中基因型T/T的频率稍高于对照组（2.8%比1.3%），但未达到显著性差异水平。西班牙［6］及意大利［5］人群中对该位点研究也均报道了阴性结果。分析这类研究结果存在差异可能有以下方面原因: （1）5-HT6受体C267T基因多态性受不同的遗传背景以及环境因素和遗传因素的相互作用的影响，导致在不同种族人群的基因多态性和遗传结构有差别。（2）5-HT6受体基因C267T变异体只是静息突变,不会引起氨基酸序列的改变,可能与染色体邻近区域的某一基因位点存在连锁不平衡，而不能通过C267T多态性分析来检测基因变异体影响阿尔茨海默病的发展。(3)有些研究由于实验样本量过小，而未能发现二者的相关性。因此，关于5-HT6受体基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究，还需要在不同的种族中扩大样本量进一步进行分子遗传学研究来证实。

【参考文献】
  1 Orlacchio A,Kawarai T, Paciotti E, et al.Association study of the 5-hydroxytryptamine (6) receptor gene in Alzheimer's disease, Neurosci. Lett，2002，325：13-16.

2 XF Hu, XR Zhang, A Xuan,et al. Association between Apolipoprotein E gene polymorphism and the patients with persistent vegetative state in the Chinese, Acta Genet. Sin， 2002，29: 757-760.

3 Tsai SJ, Liu HC, Liu TY, et al.Association analysis of the 5-HT6 receptor polymorphism C267T in Alzheimer's disease. Neurosci. Lett，1999，（276）: 138-139.

4 Rui K, BinBin W, Chuanfang Z, et al. Association of the HTR6 polymorphism C267T with late-onset Alzheimer 's disease in Chinese . Neuroscience Letters，2004，（372）: 27-29.

5 Thome J, Retz W, Baader M, et al. Association analysis of HTR6 and HTR2A polymorphisms in sporadic Alzheimer's disease. J Neural Transm，2001，（108）: 1175-1180.

6 Alvarez-Alvarez M, Galdos L, Fernández-Martínez M, et al. 5-Hydroxytryptamine 6 receptor (5-HT6) receptor and apolipoprotein E (ApoE) Polymorphisms in patients with Alzheimer's disease in the Basque Country. Neuroscience Letters，2003，（339) : 85-87.

(编辑：张 犁)

作者单位：030001 山西太原，山西医科大学第一医院老年病科