骨髓C-kit+Lin-细胞移植对小鼠四氯化碳性肝纤维化的影响*

【摘要】  目的 探讨骨髓C-kit+Lin-细胞移植对肝纤维化病变的影响。方法 16只四氯化碳性肝纤维化雌性小鼠随机分为移植组和对照组，移植组小鼠（n=8）接受同基因型雄性小鼠的骨髓C-kit+Lin-细胞移植，对照组小鼠（n=8）接受等体积的Buffer2液输注。术后30天活杀小鼠进行肝功能、肝组织HE染色和VG染色、肝组织Y染色体Sry DNA和白蛋白mRNA双重原位杂交等检查。结果 移植组的肝功能和肝结构恢复显著优于对照组，肝内纤维数量显著少于对照组，Y染色体Sry DNA阳性和白蛋白mRNA阳性的双阳性细胞仅在移植组的肝组织中出现。结论 骨髓C-kit+Lin-细胞移植可以显著改善小鼠四氯化碳性肝纤维化病变的结构和功能，可以显著增加小鼠四氯化碳性肝纤维化病变的肝细胞数量。

【关键词】  C-kit+Lin-细胞移植；四氯化碳性肝纤维化；小鼠

The action of bone marrow C-kit+Lin-cell transplantation on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in mice

    LIAO Cai-ji, LIAO Cai-xian, ZHANG Shou-hua, et al.Red Cross Hospital of Baiyun District of Guangzhou City, Guangzhou 510545,China

    【Abstract】  Objective  To know the action of bone marrow C-kit+Lin-cell transplantation on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in mice. Methods   16 female mice with carbon tetrachloride liver fibrosis were randomly divided into group A and B. The mice in group A (n=8) received syngeneic male bone marrow C-kit+Lin-cell transplantation. The animals in group B (n=8) received isovolumetric Buffer2 solutions infusion. The examination of hepatic function, hepatic tissue stained by HE and VG, double-labeling in situ hybridization of albumin mRNA and Y-chromosome Sry DNA were performed at the 30th day postoperatively.Results  Double labeling positive cells were seen only in group A. The hepatic function and morphosis restoration in group A were significantly better than those in group B. The intrahepatic fiber quantity in group A  were markedly less than those in group B. Conclusion  Bone marrow C-kit+Lin-cell transplantation could replenish hepatocytes and ameliorate remarkably the hepatic structure and function of the mice with carbon tetrachloride liver fibrosis.

    【Key words】  C-kit+Lin-cell transplantation; carbon tetrachloride liver fibrosis; mouse

    骨髓C-kit+Lin-细胞是一群富含骨髓源性肝干细胞（BMDLSC）的细胞群［1］。笔者在观察证实小鼠骨髓C-kit+Lin-细胞移植可以有效地预防放射性肝纤维化形成的基础上［2］，对已经发生肝纤维化病变的小鼠在接受骨髓C-kit+Lin-细胞移植后的变化进行了观察，发现骨髓C-kit+Lin-细胞移植可以显著改善小鼠肝纤维化病变的结构和功能，其中酒精性肝纤维化小鼠接受C-kit+Lin-细胞移植后的变化，笔者已在另文中作了报道［3］，这里报道的是四氯化碳性肝纤维化小鼠接受C-kit+Lin-细胞移植后的变化。

    1  材料与方法

    1.1  小鼠四氯化碳性肝纤维化模型的建立  SPF级纯系BALB/C雌性小鼠，6～8周龄，体重15～18g。采用四氯化碳油皮下注射法［4］，每5天皮下注射四氯化碳油4.5ml/kg（40%四氯化碳与无菌食用花生油的体积比为4：6），持续16周。造模期间给予全价营养颗粒饲料喂，随意饮水。

    1.2  小鼠分组  （1）移植组：为四氯化碳性肝纤维化雌性小鼠接受同基因型雄性小鼠骨髓C-kit+Lin-细胞移植组，共8只小鼠。（2）对照组：为四氯化碳性肝纤维化雌性小鼠接受等体积Buffer2液输注组，共8只小鼠。

    1.3  小鼠骨髓C-kit+Lin-细胞分选  纯系BALB/C雄性小鼠8只，无菌条件下获取股骨和胫骨骨髓，收集骨髓细胞悬液。经裂解红细胞、8℃条件下离心、尼龙膜过滤等处理，获得骨髓细胞悬液。应用免疫磁珠分选法［5］，第一步采用阴性分选，从骨髓细胞悬液中分选出Lin-细胞，即CD3ε、CD4、CD8a、CD45R、Gr21、Ter-119、CD11b阴性细胞。第二步采用阳性分选，从Lin-细胞中分选出C-kit+Lin-细胞。最后用Buffer2液（pH7.2 PBS +0.5%BSA +2mmol/L EDTA）重悬细胞，并将细胞浓度调节至1×109/L。

    1.4  C-kit+Lin-细胞移植  移植组小鼠均经尾静脉注入C-kit+ Lin-细胞悬液250μl（2.5×105个细胞），对照组小鼠均经尾静脉注入250μl  Buffer2液。

    1.5  观察指标与检测方法  移植后30天活杀小鼠进行如下检测。

    1.5.1  肝功能测定  内容包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)。

    1.5.2  肝组织病理学检查  内容包括HE染色和VG染色检查。

    1.5.3  肝组织白蛋白mRNA和Y染色体Sry DNA双重原位杂交检查  探针由天津瀚洋生物有限公司提供。ALB mRNA探针序列为：5'-TTGGCAAGTT  CCGCCCTGTC  ATCTGCGC (TAMRA红色荧光标记)，小鼠Y染色体性别决定基因（Sry）DNA探针序列为：5'-GCTGGGATGC AGGTGGAAAA GCCTTACAG（FAM绿色荧光标记）。杂交方法按照试剂盒所附方法，在同一张组织切片上先进行ALB mRNA杂交，后进行Sry DNA杂交。荧光显微镜观察结果。胞浆内含绿色颗粒表示该细胞含Y染色体，胞浆内含红色颗粒表示该细胞表达白蛋白，胞浆内含黄色颗粒表示该细胞既含Y染色体又表达白蛋白。

    1.6  统计学分析  数据以x± s表示，分析比较采用t检验。

    2  结果

    2.1  各组小鼠移植后30天的肝功能结果  见表1。表1  移植组与对照组小鼠在术后30天的肝功能变化 注：*P为移植组与对照组

    2.2  肝组织的病理学改变  对照组小鼠肝组织HE染色显示，大量肝细胞脂肪变性，胞浆透明。肝小叶点状坏死，汇管区纤维细胞增生，肝小叶内可见纤维间隔，假小叶形成。肝组织VG染色显示，肝内纤维重度增生，肝小叶内、汇管区及肝窦内均有大量粉红色胶原纤维沉积(图1)。

    图1  对照组小鼠肝组织(VG×100)移植组小鼠肝组织HE染色显示，肝细胞形态基本正常，无明显浊肿变性，肝小叶内无坏死灶，肝窦区无明显炎性浸润，汇管区轻度纤维增生，无明显假小叶形成。肝组织VG染色显示，肝小叶无明显纤维索，汇管区及肝窦内沉积的粉红色胶原纤维也明显少于对照组(图2)。图2  移植组小鼠肝组织(VG×100)2.3  肝组织白蛋白mRNA和Y染色体Sry DNA双重原杂交结果  对照组结果见图3，没有含黄色颗粒的双阳性细胞。移植组结果见图4，可见含黄色颗粒的双阳性细胞呈散在分布。

    3  讨论

    BMDLSC是Petersen等在1999年发现的一群细胞，它的表面标志至今没有阐明，特征性表面标志更是没有找到。CD34、CD133、Thy-1、C-kit、Sca-1、CXCR4、C1qr都有可能是BMDLSC的表面标志 ［6，7］，但都不是该细胞的特征性标志，因为这些细胞都是异质细胞群，不是匀质细胞。笔者曾对骨髓细胞中的BMDLSC进行筛选，证明骨髓C-kit+Lin-细胞是一群富含BMDLSC的细胞群［1］。

    从本实验的结果来看，移植组的肝组织结构修复显著优于对照组，移植组的肝内纤维数量显著少于对照组，移植组的肝功能恢复显著优于对照组。表明四氯化碳性肝纤维化小鼠在接受C-kit+Lin-细胞移植后，肝纤维化病变的结构在改建，肝内纤维数量在减少，肝组织结构在恢复，肝脏功能在改善。表明C-kit+Lin-细胞移植可以显著改善小鼠四氯化碳性肝纤维化病变的结构和功能。

    本实验中，移植组的小鼠肝组织中出现Y染色体Sry DNA阳性和白蛋白mRNA阳性的双阳性细胞，表明移植的C-kit+Lin-细胞已在肝内定居并产生了新的肝细胞。表明C-kit+Lin-细胞移植可以显著增加小鼠四氯化碳性肝纤维化病变的肝细胞数量。

【参考文献】
  1 廖彩仙，唐浩，周杰，等.小鼠骨髓CD90+、CD34+、C-kit+和Sca-1+细胞的肝干细胞潜能比较. 肝胆外科杂志, 2006,6：458-460.

2 唐浩，廖彩仙，周杰，等. 小鼠 C-kit++ Lin- 骨髓细胞移植生成肝细胞的实验研究.南方医科大学学报，2006，26(5):567-598．

3 廖彩佶，廖彩仙，张守华，等. 骨髓CD117+Lin-细胞移植对小鼠酒精性肝纤维化的影响.中华医学研究杂志,2009,9(1):1-3.

4 廖彩仙,张晓东,植一丹. 应用自体骨髓肝内移植治疗肝硬化的实验研究.中华医学研究杂志,2004,4(3):215.

5 张春兴, 廖彩仙, 张守华，等. 免疫磁珠分选骨髓衍生肝干细胞亚群C-kit+lin-.中国组织工程研究与临床康复,2007,11(7):1232-1234.

6 Crosby HA. Human hepatic stem-like cells isclated using C-kit++ or CD34 can differentiate into biliary epithplium. Gastroenterology,2001,120:534-544.

7 Kucia M, Wysoczynski M, Ratajczak J, et al.Identification of very small embryonic like (VSEL) stem cells in bone marrow.Cell Tissue Res，2008，331(1):125-134.

(编辑：欣 阳)

作者单位：国家自然科学基金（编号：30371385），广东省自然科学基金（编号：04020419） 1 510545 广东广州，广州市白云区红十字医院外一科 2 510515 广东广州，南方医科大学南方医院肝胆外科（△通讯作者）