DNA甲基化与肿瘤

【摘要】  DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶介导，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。DNA甲基化作用的发生和甲基化水平的高低主要取决于DNA甲基化酶。涉及到个体的发育、细胞增殖、分化、基因组印记、X染色体失活、基因表达调控和碱基突变等多方面的生物学功能，具有重要的生物学意义［2］。

【关键词】  DNA;甲基化;肿瘤

DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶介导，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。这种修饰反应主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶。在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一天然存在的酶性修饰碱基，哺乳动物中5-甲基胞嘧啶约占C总量的2%~7％［1］。CG二核苷酸是最重要的甲基化位点，在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化区、低甲基化区和非甲基化区。DNA甲基化作用的发生和甲基化水平的高低主要取决于DNA甲基化酶。不同于原核DNA甲基化酶的是，真核DNA甲基化酶只有一种，即5-胞嘧啶甲基转移酶。此酶分子量较大，对蛋白水解酶非常敏感，故对它的研究较晚。Riggs在l975年提出DNA甲基化酶应存在两类，一类是维持型DNA甲基化酶，以半甲基的双链DNA为底物，在未甲基化的DNA链的对称位点上(如CG)完成甲基化，可确保甲基化方式的遗传。另一类为从头甲基化酶，则作用于非甲基化的DNA链，产生半甲基化的DNA。甲基化通过图式和数量的改变，在生物遗传信息的调节过程中起重要作用。涉及到个体的发育、细胞增殖、分化、基因组印记、X染色体失活、基因表达调控和碱基突变等多方面的生物学功能，具有重要的生物学意义［2］。

    1  甲基化胞嘧啶的分布和CpG岛

    真核性染色体组并非均一地被甲基化,而是在非甲基化区域中散在甲基化的区域。二核苷酸CpG在染色体组中地出现频率为5%~10%。在包括人在内的大多数脊椎动物中,大约70%~80%CpG位点中包含甲基化的胞嘧啶［3］。这些甲基化区域为典型的大块型染色质，提示它们为含有组蛋白成分，核小体构型及相关转录因子的新近复制DNA。与此相反，染色体组中有一些称作CpG岛的小区域，这些区域未被甲基化，GC丰富(60%~70%)，CpG/GpC至少为0.6，区域跨度为0.5~5Kb不等，出现频率为1/100Kb。含有CpG岛的染色质通常被高度乙酰化，缺乏组蛋白H1，包含一个无核小体区域。

    在鼠和人所有基因中，大约一半包含有CpG岛。CpG二核苷酸聚集区域称为CpG岛(CpG island)。CpG岛长约0.5~2.0Kb，呈不连续分布。理论上讲，CpG二核苷酸含量应有1/16,但由于生物学上的C-G抑制现象，实际上哺乳动物细胞基因组中C-G含量仅为1％，但C-G抑制现象并不适用于CpG岛［4］。整个基因组中，CpG岛通常位于基因的启动子区域，故亦称5’-CpG岛。与其他CpG二核苷酸不同，正常情况下CpG岛是以非甲基化形式存在的。

    2  DNA甲基转移酶

    将甲基转移至胞嘧啶环的酶称为胞嘧啶5-甲基转移酶(Dnmt)。目前已经发现和鉴定了三种DNA甲基转移酶，Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3，其中Dmnt3又有a、b两种亚型［5］。Dnmts家族中起主要作用的有Dnmtl、Dnmt3a和Dnmt3b三种酶。Dnmtl主要是维持甲基化状态，Dnmt3a和Dnmt3b则具有使未甲基化的DNA重新甲基化的作用。DNA甲基转移酶作用的靶点是DNA中回文结构的CpG。在新近复制的DNA分子中，DNA呈半甲基化状态，即亲链甲基化、子链未甲基化。哺乳动物DNA甲基转移酶与这种半甲基化底物有高度亲和性。

    3  研究DNA甲基化的方法

    3.1  酶切法  该法是检测基因组DNA甲基化水平的一种常用方法。提取基因组DNA，采用对5-甲基胞嘧啶敏感的限制性核酸内切酶作用于基因组DNA。对于不存在甲基化的DNA标本，核酸内切酶会在识别序列处切断DNA双链；对于存在甲基化的DNA标本，则不能切断DNA，然后以琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。不同的核酸内切酶识别序列不一样，根据实验目的选择不同的核酸内切酶。

    3.2  限制酶PCR(restriction enzyme PCR)  基因组DNA分别经甲基化敏感和非敏感的核酸内切酶酶切后为模板，用待检甲基化位点外侧序列为引物进行扩增。甲基化敏感的内切酶酶切后的DNA若存在甲基化，则会扩增出包含有甲基化CpG位点的片段；若不存在甲基化则不会有任何片段扩出。当用甲基化非敏感的内切酶酶切后的DNA为模板时，不论该部位是否甲基化都不应有片断扩出。

    3.3  甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS PCR)  该法是检测基因组DNA甲基化水平的一种常用方法，原理是DNA经亚硫酸氢钠处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时，有两套不同的引物对：其一引物序列来自经处理后的甲基化DNA链，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物来自经处理后的非甲基化DNA链，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA序列无互补配对。

    3.4  Southern 印迹法  Southern印迹是用甲基化敏感和非敏感的核酸内切酶对DNA进行酶切，对不同位点CpG甲基化的分析需选择针对该位点特异的核酸内切酶，酶切后的片段经电泳分离后转移至尼龙膜上，然后用与目的片段特异的探针进行杂交，经显影后即可分析待检片段的甲基化状态。

    以上介绍的只是一些常用的方法，现在还开展了一些新的快速方法如：亚硫酸盐测序、变性高效液相色谱、PCR荧光变性曲线分析等［6］。

    4  DNA甲基化和转录抑制

    在大量的基因中观察到胞嘧啶甲基化与转录反相关，但其确切的作用机制尚不十分清楚。目前有三种可能的机制来解释DNA甲基化对转录的抑制：第一种机制是DNA甲基化直接参与干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合；第二种机制是通过在甲基化DNA上结合上特异的转录阻遏物，或称为甲基-CpG结合蛋白而起作用的；第三种甲基化抑制机制是改变染色质结构［7］。

    5  DNA甲基化与肿瘤

    5.1  肿瘤细胞中C-T突变  CpG位点是肿瘤中癌基因和抑癌基因突变的热点。例如在已经调查的人类肿瘤中，p53基因在50％以上的实体瘤中存在突变，而约24％的突变发生在CpG位点，为C-T突变。该突变在结肠癌中几乎达到50%。CpG二核苷酸自发突变的频率远高于其他二核苷酸。5-mCpG二核苷酸中的5-mC能以较高的速率脱氨基转换为T，非甲基化C也可以脱氨基转换为U，但是DNA需要经过2次复制周期后，C才能突变为T，所以C突变为T的速率低于5-mC突变为T的速率。虽然5-mC转换为T的纯速率较C只高约两倍，但实际情况是5-mC突变为T的速率比非甲基化C高10~40倍，因为5-mCpG的高突变率还有其他原因：第一，5-mC和C自发脱氨基分别形成T：G错配对和U:G错配对，由于U不是DNA的正常成分，U:G错配对易被U-DNA糖基化酶识别而被切除，再经β-DNA聚合酶修复，使U:G错配对恢复为C:G配对。而T:G错配不易被T-DNA糖基化酶切除，因而发生C-T突变。第二，DNA复制后产生少量T:G-T:A的错误修复，使原来的C:G变成了T:A。另外，DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferasel，Dnmtl)具有酶促5-mC或C转变为T的作用，也增加了C-T突变。

    5.2  肿瘤中的低甲基化  通常在肿瘤形成早期或肿瘤结构形成之前，整个基因组甲基化水平降低，而且特定的癌基因在人类肿瘤中也出现低甲基化。例如，bcl-2基因在慢性B淋巴细胞白血病中的低甲基化和k-fas基因在肺癌、结肠癌中的低甲基化与它们的高水平表达有关。异常高表达的基因表现为低甲基化状态，说明低甲基化在肿瘤发生中起一定作用。可能在细胞群体中,那些本来就显示低甲基化的细胞具有形成肿瘤的优势，DNA低甲基化可能是导致肿瘤形成的祖先细胞克隆扩大的关键因素之一。

    5.3  肿瘤抑制基因的高甲基化  除点突变、基因缺失外，启动子区高甲基化导致转录失活是肿瘤中抑癌基因失活的一种表现。肿瘤抑制基因的高甲基化作为基因失活的机制首先在人类散发性视网膜母细胞瘤Rb基因中证实，此后的研究表明Rb基因启动子区的高甲基化直接抑制了启动子的活性。在大多数实体瘤中p16的5'-CpG岛存在高甲基化。用5-氮杂胞苷(能减少基因中的甲基化位点)处理p16高甲基化的细胞株,可以使其重新具有转录活性。现在已发现许多基因在肿瘤中因高甲基化而失活，如p15、APC、THBSl等。

    5.4  诱导染色体的不稳定性  Chen等在分析缺乏DNA甲基转移酶1(Dnmtl)的胚胎干细胞时，发现染色体重组或丢失导致其基因丢失率比野生型细胞要高得多，表明低甲基化可导致染色体不稳定。Lengauer等把富合CpG的β-半乳糖苷酶基因用逆转录病毒导入10个结肠癌细胞株，5个没有表达β-半乳糖苷酶，这些细胞株都为错配修复缺陷型(MMR－)，而MMR＋细胞株可表达该基因，用5-氮杂胞苷处理，诱导MMR-细胞β-半乳糖苷酶基因的表达，通过Southern分析表明MMR-细胞株为MET+(有甲基化能力)，而MMR+为MET-。因此认为MMR+细胞株无甲基化能力，直接促使了整个染色体的获得和丢失，从而导致了肿瘤发生、发展所必需的基因组不稳定［8,9］。

    6  与DNA甲基化有关的临床和治疗

    在肿瘤中高频率出现的甲基化基因可以作为临床诊断、病程监控的分子标志物。肿瘤中DNA甲基化改变与临床具有潜在的关联，这种变化是微小转移的一个敏感指标，在这种情况下也具有一定预后价值。既然某些特定生长相关基因的点突变和基因表达缺失与DNA甲基化机制有关，那么修正基因的甲基化状态就有可能成为一新的肿瘤治疗途径。去甲基化治疗肿瘤的设想是建立于以下基础上的:(1)理论上，无突变或缺失、仅出现高甲基化的生化抑制基因如能重新表达，细胞生长抑制功能就会得到重建。(2)正常体细胞中，受CpG岛甲基化机制控制表达的基因较少，因此，诱导基因组去甲基化，将不会造成各种基因的不适当表达。(3)甲基化异常所致灭活的基因对DNA甲基化抑制剂非常敏感，易重新活化。目前已知的胞嘧啶甲基化转移酶特异抑制剂为5-氮杂胞苷。最近，将此药应用于临床治疗高危MDS患者，取得了一定疗效，但同时存在着不容忽视的毒副作用。为此，有必要考虑进行药物联用和寻找新的DNA胞嘧啶甲基化转移酶抑制剂。Cote等应用全反式维甲酸和5-杂氮胞苷协同作用DLD-l大肠癌细胞系，有效地抑制了肿瘤细胞的生长。主要是5-杂氮胞苷先使DLD-l细胞中甲基化的维甲酸受体基因重新表达，随后全反式维甲酸发挥其药理学作用。有学者应用硫代磷酸化的MeTase反义核酸抑制Y1肾上腺皮质瘤细胞内MeTase mRNA的表达，从而可降低胞嘧啶DNA甲基化转移酶的活性。在体外MeTase反义核酸以剂量依赖性的方式抑制Y1细胞的生长。将此反义核酸注射人LAF1同系小鼠腹腔，可显著抑制Yl肿瘤细胞的生长，并能降低MeTase水平，同时诱导肾上腺皮质特异性基因C21的去甲基化，使该基因重新得到表达［10,11］。据此，我们认为积极寻找新的DNA甲基化转移酶抑制剂，加强去甲基化诱导肿瘤的基础研究具有十分重要的意义。总之，肿瘤的发生不仅与多种基因的遗传性改变有关，而且多基因的异常甲基化引起的表遗传改变也起很大的作用。肿瘤发生是多基因的遗传和表遗传共同起作用的结果。由以上研究结果可以看出，目前人们正在对甲基化进行不断的深入的研究，并且取得了较大的进展。

    7  问题与展望

    DNA甲基化在脊椎动物中起着重要的调节作用。有充分的证据说明DNA甲基化在发育和细胞分化过程中对特异基因的静止起重要作用。5-mC固有的诱变性、低甲基化激活原癌基因、高甲基化使肿瘤抑制基因转录失活、由于不能重新甲基化而引起的染色体分离过程中的缺失等因素均可导致肿瘤形成。DNA甲基化的选择性调节在临床上可以用来预防和治疗肿瘤。要制定安全有效的针对改变DNA甲基化的治疗策略，必需彻底搞清楚对甲基化和去甲基化过程起特异性调节作用的因素。同样，搞清楚参与DNA甲基化诱导基因静止的因素可以使试图选择性调节基因表达的努力变得更为容易［12］。最近的研究已经将DNA甲基化和组蛋白乙酰基作用两种整体机制联系起来，但仍须对DNA甲基转移酶、去甲基酶、甲基胞嘧啶结合蛋白、组蛋白去乙酰基作用及基因转录静止之间的复杂联系作进一步研究。

【参考文献】
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8 林立,佘朝富.DNA甲基化及其在肿瘤中的作用.国外医学.临床生物化学与检测学分册,2002,23(5):278-280.

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10 刘永忠.DNA甲基化与肿瘤发生、治疗的研究进展.中国癌症杂志,1999,9(3):258-260.

11 白坚石,何忠效.DNA甲基化作用对细胞癌变的影响.生理学进展,2000,31(1):50-52.

12 范保星,张开泰.DNA甲基化与肿瘤.国外医学:分子生物学分册,2002,24(3):139-143.

(编辑：张 犁)

作者单位：433100 湖北潜江，潜江市中心医院药剂科