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【摘要】 目的 观察仿生肝病治疗仪对慢性乙型肝炎（CHB）患者细胞免疫和乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响，旨在探讨该治疗仪治疗CHB的作用和作用机制。方法 仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗免疫耐受期的CHB患者，并设单用拉米夫定对照组。用ELISA法和实时荧光定量PCR法分别检测治疗前和治疗12周及24周时两组患者PBMCs上清液INF-γ和血清HBV-DNA含量。结果 仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗后，诱生PBMCs产生IFN-γ显著增强（P<0.05～0.01），HBV-DNA有效下降率也显著高于对照组（P<0.05）。结论 仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗CHB可上调CHB患者细胞免疫应答，诱生细胞因子IFN-γ，抑制HBV复制，优于单用拉米夫定治疗。
【关键词】 仿生肝病治疗仪； 慢性乙型肝炎； IFN-γ； HBV
【中图分类号】 R-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2010)01-0013-03
Modulatory function of HDBMI to immune responses in CHB patients
XIONG Yi-li，XIONG Wei-hong,WANG Zeng-song.
Department of Liver Disease,Renai Tianhe Hospital,Guangzhou 510620,China
【Abstract】 Objective To observe the clinical effects of the bionic medical-instrument with microcomputer on hepatic diseases of type WF(HDBMI) on cellular immune response and reproduce of HBV in chronic hepatitis B(CHB) patients. Methods The CHB patients in stage of immune tolerance were treated separately with HDBMI plus Lamivudine in the therapeutic group and only with Lamivudine in control group. Before treatment and at treatment point of 12 week and 24 week ,IFN-γ levels in the culture supernatant of PBMCs were determined by ELASA and the contents of serum HBV DNA were detected by the PCR method in all patients of two groups.Results The levels of IFN-γ were obviously enhanced(P<0.05～0.01) and percentage to inhibited serum HBV DNA was significantly inceased (P<0.05) in the therapeutic group than that in the control group. Conclusion HDBMI plus Lamivudine can upregulate cellular immune responses, induce IFN-γ, inhibit the reproduce of HBV DNA and is quite effective than Lamivudine alone.
【Key words】 HDBMI; chronic hepatitis B; IFN-γ; HBV
慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）迁延难愈和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV）持续感染的主要原因是机体对HBV产生了免疫耐受。通过免疫调节，打破免疫耐受，增强细胞免疫应答，使机体主动清除HBV，已成为CHB治疗的研究热点［1］。近年发现多种肝病治疗仪在辅助治疗CHB时取得较好疗效，但其作用是否与纠正CHB免疫耐受有关，还有待证实［2～4］ 。本研究用WF微电脑仿生肝病治疗仪（以下简称"仿生肝病治疗仪" ）联合抗病毒药拉米夫定治疗免疫耐受期的CHB患者后，检测患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）和血清HBV-DNA含量。观察仿生肝病治疗仪对细胞免疫和HBV复制的影响，以探讨其治疗CHB的作用和作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 据中华医学会《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，选择2009年来本院就诊的慢性乙肝患者40例，男27例，女13例；年龄21～40岁。均为HBsAg阳性、HBeAg阳性、HBV-DNA＞104、ALT和AST正常（免疫耐受期）、未接受过抗病毒治疗并排除HAV、HCV、HDV、HEV混合感染和药物、酒精、中毒等造成的肝损害。拉米夫定（葛兰素史克公司）,WF微电脑仿生肝病治疗仪（江苏中普科技公司）；重组HBsAg疫苗（深圳康泰生物制品公司），RPMI-1640、Hanks'（GIBCO, 美国），胎牛血清（GIBCO, 美国），Ficoll淋巴细胞分离液（上海华精公司），Anti-human CD3（BioLegend，美国），人IFN-γ酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒和TMB 底物显色剂（BD-Pharmingen，美国），HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒（达安基因公司）；Multiskan MK3酶标仪（芬兰Thermo公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组及治疗方法
1.2.1.1 治疗组 选免疫耐受期的乙肝患者20例，口服拉米夫定0.1g/次，1次/日×24周。用仿生肝病治疗仪，30min/次，1次/周×24次。患者平卧位，仿生肝病治疗仪电极隔纱布垫置于肝区，电信号刺激强度据患者耐受程度调整，逐渐增强。
1.2.1.2 对照组 选免疫耐受期的乙肝患者20例，口服拉米夫定0.1g/次，1次/日×24周,不用仿生肝病治疗仪治疗。
两组均在治疗前、治疗第12周和第24周时抽血，分别检测患者外周血PBMCs上清液INF-γ和血清HBV-DNA含量。
1.2.2 检测方法 取受检者新鲜外周静脉血5ml/人，肝素20U/ml抗凝，经RPMI-1640 1：1稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液按常规方法分离PBMCs，RPMI-1640洗涤2次，最终用RPMI-1640（1ml，含10%胎牛血清）悬浮细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。用台盼蓝检测细胞活力，细胞活力＞95%以上备用。将细胞悬液加入96孔培养板中（100μl/孔）。每孔加入HBsAg（0.5μg/ml）100μl ，并设生理盐水空白对照和抗人CD3阳性对照。置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育48h后，无菌条件下每孔收集50μl上清液，用ELISA法检测上清液中INF-γ含量。血清HBV-DNA含量检测用荧光定量PCR方法，参考检测试剂盒说明书。
1.3 统计学处理 本文检测数据用x±s表示 ,采用SPSS13.0软件处理进行t检验和χ2检验。
2 结果
见表1、表2。表1仿生肝病治疗仪对慢性乙肝患者PBMCs诱生IFN-γ的影响 (x±s)注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01 表2两组慢性乙肝患者治疗24周时HBV-DNA有效下降率（略）注：与对照组比，*P<0.05
3 讨论
CHB免疫耐受是指宿主细胞免疫功能缺陷，对HBV抗原不产生特异性免疫应答或低应答，导致免疫系统与HBV"和平共处"，造成HBV持续复制［5］。HBV进入人体后，首先由树突状细胞（Dentritic cell, DC）在外周组织识别、摄取、处理HBV后，把HBV抗原递呈给T细胞并激活之。活化T细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-2等，来清除HBV［6］。HBV慢性感染者，DC递呈HBV能力低下，使T细胞活化受限，产生细胞因子IFN-γ等免疫活性物质减少，出现对HBV无应答或低应答。因而寻找免疫调节疗法，激活细胞免疫，诱生IFN-γ等细胞因子，清除HBV是治疗CHB的重要环节［7］。
近年国内外研制了多种肝病治疗仪来治疗CHB,该类仪器根据中医经络学理论, 运用计算机精控技术,电子脉冲技术,通过电子波刺激人体穴位，产生电、热、磁、药作用而达到疏经通络，改善微循环，辅助清除病毒等［2～4］。但治疗仪对CHB的免疫调节作用尚未见报道。本研究发现：仿生肝病治疗仪联合拉米夫定治疗后，诱生患者PBMCs产生IFN-γ显著高于单用拉米夫定组（P<0.05～0.01），且随着治疗次数、时间的增加，这种增强特异性细胞免疫应答的作用也随之增强。与此同时治疗组HBV-DNA有效下降率也显著高于对照组（P<0.05）。说明治疗仪能上调特异性细胞免疫应答，诱生细胞因子IFN-γ，从而打破免疫耐受，抑制HBV复制，达到主动清除HBV的作用。此结果为仿生肝病治疗仪治疗CHB的作用和作用机制提供了重要的实验依据。
CHB的免疫治疗应以打破免疫耐受为始动，调节异常细胞免疫应答为中心，清除肝细胞内HBV为目的来进行。单一的免疫疗法想彻底清除HBV，治愈CHB很难，抗HBV治疗迄今仍是关键的治疗措施［8］。抗HBV药拉米夫定等，可抑制HBV复制，但难以彻底清除HBV，疗效远不令人满意。可见单一的抗HBV与单一的免疫疗法都有一定局限性，因而对CHB多需两者联合治疗才能奏效［9］。但如何发挥各自的优点，并使两者相辅相成？如何使抗HBV有多位点，多途径，主动加被动？如何高效而无反跳的抑制和清除肝细胞内HBV？这些要求使免疫疗法与抗HBV药物的联合应用成了当今亟待解决的问题之一［10］。鉴于此，我们选用了仿生肝病治疗仪与拉米夫定联合治疗方案。研究结果表明：此联合治疗方案对CHB的疗效优于单用抗HBV药。但本研究病例数尚有限，该治疗方案的有效性还有待进一步验证。
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