赛来昔布联合热疗对胰腺癌细胞凋亡的影响

【摘要】  目的 体外研究选择性环氧合酶-2抑制剂赛来昔布联合热疗对人胰腺癌SW1990细胞凋亡的影响。方法 MTT研究热疗、赛来昔布及其联合作用对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用。流式细胞仪和电镜研究各不同处理因素对SW1990细胞凋亡的影响，RT-PCR检测bcl-2、bax在各组细胞中的表达。结果 MTT示联合组对细胞生长抑制作用最明显；电镜、流式细胞仪示热疗、赛来昔布及联合作用均可诱导细胞凋亡；但凋亡比例联合组> 赛来昔布组>热疗组>对照组。RT-PCR示在各处理组中bax表达明显上调，尤以联合组为明显。而bcl-2在各组间差异无显著性。结论 赛来昔布联合热疗对胰腺癌SW1990细胞生长具有协同抑制效应。赛来昔布联合热疗可能通过上调bax的表达诱导胰腺癌细胞凋亡。

【关键词】  胰腺癌；赛来昔布；热疗；bax

【中图分类号】  R-33        【文献标识码】  A        【文章编号】  1680-6115(2010)01-0005-05

　　 Effect of Celebrex combined with thermotherapy on apoptosis of pancreatic carcinoma cell

　　LIU Li-yan, WANG Xing-peng, WU Kai, et al.

　　Department of IMCC, Shanghai First People's Hospital, Medical College of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080，China

　　【Abstract】  Objective  To study the effect of Celebrex (a kind of selective Cyclooxygenase-2 inhibitor) combined with thermotherapy on apoptosis of human pancreatic carcinoma SW1990 cell in vitro.  Methods  SW1990 pancreatic cancer cells were treated with thermotherapy or Celebrex or their combination. MTT evaluated cell viability. Electron microscopy and Flow cytometry observed the cell apoptosis. RT-PCR was used to investigate the expression of bcl-2 and bax.  Results  MTT assay demonstrated that all treated groups had an obviously inhibitory effect on the growth of SW1990 cells, especially in combination group. Apoptosis was observed in all treated groups through flow cytometry and electron microscopy. But the apoptosis ratios: combination group>Celebrex group>thermotherapy group>control group. RT-PCR showed bax was up regulated in all managed groups, especially in combination groups. However bcl-2 expression was no difference between every group. Conclusion  Celebrex combined with thermotherapy have a synergistic inhibitor effect on the growth of human pancreatic carcinoma in vitor. Thermotherapy combine Celebrex may up-regulate the expression of bax to induce tumor cell apoptosis.

　　【Key words】  pancreatic carcinoma; Celebrex; thermotherapy; bax

　　环氧合酶(Cyclooxygenases, COXs)是花生四烯酸(AA)转化成前列腺素（PGs）所必需的重要限速酶，分为两种亚型即COX-1和COX-2。COX-2属诱导性酶，在多种肿瘤组织如直结肠癌、胰腺癌、乳腺癌等中普遍存在过度表达现象［1］。多项研究表明，COX-2与多种肿瘤的发生、发展和转移密切相关。而各种体内外实验也证明COX-2抑制剂可从一个或多个环节阻断COX-2的致癌机制进而抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤的发病率［2］。

　　热疗作为治疗肿瘤的一种重要手段目前已越来越引起人们的关注，大量研究表明热疗与化疗联合应用可明显控制肿瘤的生长，提高病人的生存率［3］。

　　细胞凋亡在肿瘤发生发展中起重要作用，癌基因与肿瘤形成的关系证实：原癌基因如bcl-2基因家族成员是决定细胞凋亡的重要因素，它的激活、过度表达与肿瘤的形成密切相关［4］。本研究通过体外实验给予热疗、COX-2抑制剂赛来昔布及两者联合观察它们对人胰腺癌SW1990细胞凋亡的影响以及bcl-2凋亡相关基因表达的变化，以探讨赛来昔布联合热疗对胰腺癌细胞凋亡的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器和试剂

　　1.1.1  主要仪器  酶标仪（美国Bio-Tek Instruments公司）、水浴恒温箱（温差±0.5℃，上海医用恒温设备厂）、二氧化碳培养箱（日本Sanyo公司）、透射电镜（荷兰Philips公司）、PCR扩增仪（GENE公司），流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

　　1.1.2  试剂  DMEM培养基（GIBCO公司），小牛血清（普飞生物工程公司），Trizol试剂（GIBCO公司），逆转录聚合酶链式反应试剂盒（晶美生物工程公司），PCR引物（上海赛百盛公司），MTT（上海华舜公司），赛来昔布（美国希尔公司）。

　　1.2  细胞株

　　1.2.1  细胞株  人胰腺癌细胞系SW1990细胞（ATCC）。

　　1.2.2  细胞培养  SW1990细胞接种于DMEM培养基（含10%小牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素），置37℃，5%CO2条件下培养。隔日传代。

　　1.3  四唑氮蓝还原法（MTT）检测细胞的增殖  对数生长期细胞制成5×104/ml单细胞悬液分装于40只EP管中。分为对照组、DMSO组（赛来昔布用DMSO溶解）、热疗组、赛来昔布组、联合组，每组8管。依之前的研究结果［5］将恒温水浴箱调至44℃并稳定4h以上，热疗组和联合组44℃热疗1h。将5组细胞同时接种于96孔板，每组重复8孔，并设空白对照用于调零。孵育24h赛来昔布组、联合组加赛来昔布 100μmol/L，DMSO组加等量DMSO，继续培养24h，各孔加MTT溶液20μl（5mg/ml），37℃孵育4h，PBS轻洗后每孔加150μl二甲基亚砜，振荡10min，酶标仪测A490值。细胞存活率＝（实验组OD值/对照组OD值）×100％。

　　1.4  流式细胞仪及电镜检测细胞凋亡情况  取1×105/ml单细胞悬液3ml接种于25ml培养瓶中，待细胞生长至对数生长期时，对照组细胞正常培养；热疗组44℃热疗1h，37℃复温2h；赛来昔布组和联合组加入100μmol/L的赛来昔布，继续孵育24h；联合组再予44℃热疗1h，37℃复温2h。四组细胞分别送流式细胞仪及PHILPS CM-120透射电镜观察和检测细胞凋亡情况。

　　1.5  PT-PCR检测凋亡相关基因mRNA的表达  常规提取RNA，再按逆转录聚合酶链式反应试剂盒说明书，逆转录得cDNA。合成的引物序列见表1。表1 PCR引物 常规PCR扩增。循环参数如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，最佳退火温度30s，72℃延伸30s。35个循环后，72℃延伸10min。以GAPDH为内参照。PCR反应产物置1.5％琼脂糖凝胶电泳。用美国GeneGenius凝胶电泳成像系统观测，实验重复3次。

　　1.6  统计学方法  所用数据以x±s来表示。应用SPSS10.0统计软件对组间数值采用方差分析，配对数据采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  MTT检测胰腺癌SW1990细胞增殖  MTT结果表明各处理组对SW1990细胞生长皆有抑制作用。热疗组细胞存活率为(56.63±5.78)%，赛来昔布组为(44.55±4.76)%，联合组为(21.83±2.33)%，各组两两比较皆有显著统计学差异（P<0.01），可见联合组对肿瘤细胞抑制率显著高于热疗组或赛来昔布组（见表2，图1）。图1 MTT检测不同处理因素对SW1990细胞生长的影响 提示赛来昔布联合热疗对胰腺癌细胞系SW1990细胞的增殖具有协同抑制效应。

　　2.2  流式细胞仪检测四组细胞凋亡比例  检测结果显示热疗组，赛来昔布组及联合组皆可引起细胞凋亡比例增加。对照组细胞凋亡比例为6.66%，热疗组细胞凋亡比例为11.78%，赛来昔布组细胞凋亡比例为17.33%，而联合组细胞凋亡比例更是上升到33.32%，几乎为热疗组的3倍，赛来昔布组的两倍（见图2）。图2流式细胞仪检测4组细胞凋亡比例 表2 MTT法检测不同处理因素对SW1990细胞

　　2.3  电镜观察4组胰腺癌细胞的凋亡  电镜下观察可见热疗组、赛来昔布组及联合组皆可致SW1990细胞发生明显的形态学变化，电镜下对照组细胞外形完整，各细胞器形态正常，细胞核完整，染色质均匀分布于核质中，很少查见细胞凋亡。而各治疗组均可见细胞明显缩小，细胞膜光滑完整，微绒毛消失，部分胞膜可见泡状突起，多数细胞质密度增加浓染。细胞器结构紊乱消失，内呈现大量的空泡化，核膜尚完整，部分可见高度皱襞，核内染色质浓集，并沿核膜呈团块状、均质化分布，呈现明显凋亡表现。且电镜下细胞凋亡数联合组>赛来昔布组>热疗组>对照组（见图3）。图3 电镜(×5000倍)观察不同处理组胰腺癌细胞凋亡情况

　　2.4  PT-PCR检测细胞株和移植瘤组织中凋亡相关基因mRNA的表达  结果示胰腺癌SW1990细胞中bcl-2几乎不表达，予不同处理因素干预后，也无明显变化；而bax在对照组表达较弱，在热疗组，赛来昔布组及联合组中，表达明显上调，并成渐强趋势，以联合组最明显（见图4）。图4 RT-PCR检测不同细胞组凋亡相关基因bax、bcl-2的表达

　　3  讨论

　　MTT结果显示热疗、 赛来昔布及两者联合对SW1990细胞生长都有抑制作用，但以两者联合对肿瘤细胞生长的抑制作用最明显。提示赛来昔布联合热疗对胰腺癌细胞SW1990的生长具有协同抑制作用。

　　细胞凋亡机制在肿瘤治疗中占重要地位，热疗可通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用［6］，而COX-2选择性抑制剂在多项体内、体外实验中，也通过COX依赖性和非依赖性途径诱发肿瘤细胞凋亡［7］。本研究通过电镜观察和流式细胞仪检测，发现热疗、赛来昔布及其联合作用均可诱导SW1990细胞凋亡，使细胞凋亡比例增高，但细胞凋亡比例联合组> 赛来昔布组>热疗组>对照组，尤其是联合组，其细胞凋亡比例近乎热疗组的3倍，赛来昔布组的2倍。提示赛来昔布联合热疗可协同促进胰腺癌细胞凋亡。

　　凋亡是一个复杂的多阶段过程，涉及bcl-2基因家族、Ced基因家族、p53、Jun、Fos等众多基因。其中bcl-2基因家族倍受关注。这类基因可能作用于各种凋亡途径共同的最后通道,调控细胞凋亡,其不但在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用,同时也是影响肿瘤治疗疗效的重要因素［4］。bcl-2及其家族成员中bcl-2属促细胞生存组,其能促进细胞存活,抑制凋亡发生。而bax与bcl-2相反，促细胞死亡。研究发现bax基因在肿瘤组织中呈低表达或存在突变,并且这些细胞对凋亡具有抵抗性,对放疗、化疗反应不佳,而上调其表达,则能提高疗效。表明bax能抑制肿瘤的生成,促进细胞凋亡［8］。细胞对凋亡的易感性依赖于bax／bcl-2的比值，当bax／bcl-2升高时，可激活其下游的Caspase-3物质，从而促肿瘤细胞凋亡。本研究RT-RCP结果显示，抑制凋亡基因bcl-2在SW1990胰腺癌细胞中表达极弱，且各组间差异无显著性；而bax在热疗组、赛来昔布组、联合组中表达明显上调，尤以联合组bax上调的最为明显。这与流式细胞仪检测结果相符，提示赛来昔布联合热疗可能通过进一步上调bax的表达诱导SW1990细胞凋亡，进而发挥协同抑制效应。

　　总之，热疗、赛来昔布及两者联合均有诱导胰腺癌细胞凋亡的作用，而两者联合进一步促进了肿瘤细胞的凋亡。赛来昔布联合热疗可能通过上调bax的表达诱导胰腺癌细胞凋亡从而发挥赛来昔布对胰腺癌热疗的协同抑制效应。

【参考文献】
  　1 Sato N, Maehara N, Goggins M. Gene expression profiling of tumor-stromal interactions between pancreatic cancer cells and stromal fibroblasts. Cancer Res，2004,64(19): 6950-6956.

　　2 Schmidt CM, Wang Y, Wiesenauer C. Novel combination of cyclooxygenase-2 and MEK inhibitors in human hepatocellular carcinoma provides a synergistic increase in apoptosis. J Gastrointest Surg， 2003, 7(8): 1024-33.

　　3 Glehen O, Cotte E, Schreiber V, et al. Intraperitoneal chemohyperthermia and attempted cytoreductive surgery in patients with peritoneal carcinomatosis of colorectal origin. Br J Surg,2004,91(6):747-754.

　　4 Davidson B, Risberg B, Berner A,et al. Expression of cell cycle proteins in ovarian carcinoma cells in serous effusions-biological and progrostic inplication. Gynecol Oncol, 2001,83(20):249-256.

　　5 刘丽燕，王兴鹏，吴恺，等. 胰腺癌SW1990细胞热疗温度及机制初探. 胰腺病学, 2005, 5:143-146.

　　6 Yonezawa M, Otsuka T, Kato T,et al. Hyperthermic induction of apoptosis in malignant fibrous histiocytoma cells: possible involvement of a p53-independent pathway in the induction of bax gene. J Orthop Sci,2002,7(1):117-122.

　　7 Mohammed SI, Bennett PF, Craig BA, et al. Effects of the cyclooxygenase inhibitor, piroxicam, on tumor response, apoptosis and angiogenesis in a canine model of human invasive urinary bladder cancer. Cancer Res, 2002, 62(2): 356-358.

　　8 Inoue S, Salah-Eldin AE, Omoteyama K, et al. Apoptosis and anticancer drug resistance. Hum Cell, 2001,14(3): 211-221.