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【摘要】 目的 为了准确检测抗毒素类制品的F(ab')2含量，客观地反映制品的纯度。方法 采用了中检所血清室提供的方法（以下称为改良法）和2005版《中华人民共和国药典》三部中F(ab')2测定方法（以下称为原方法），用以上两种方法分别对15批破伤风抗毒素进行了3次测定。结果 两种方法的结果差异有显著性（P＜0.05）。原方法检测结果普遍低于改良法，而且电泳时间长至7～8h，电泳区带较宽，分辨率低。结论 改良法不仅电泳时间短、分离效果好，而且结果真实可靠，能够真实反映制品的F(ab')2含量，同时也能准确的确定血浆经过胃酶消化正常生产制品中含有不同分子量的聚集体、聚合体、Fab、Fc片段以及小分子量杂质及其含量范围，实验结果表明改良法优于原F(ab')2测定方法。
【关键词】 抗毒素； F(ab')2；电泳
【中图分类号】 R446.69 【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2010)01-0010-03
Improvement on determination method for antitoxin F (ab ')2
FENG Hong,XU Ying, XIONG Lin-na , et al.
Lanzhou Institute of Biological Products, Lanzhou 730046, China
【Abstract】 Objective In order to check the content of F(ab')2 in antitoxin precisely , and objectively reflect the purity of products. Methods Measured 15 batches of tetanus antitoxin three times by two different ways respectively, one way was called improved method, which was provided by the Department of Serum Products,National Institute for the Control Of Pharmaceutical and Biological Products, the other was from Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Results Two methods were significantly different(P<0.05). The content tested from 2005 edition of Pharmacopoeia of the People's Republic of China was generally lower than the improved method, and the electrophoresis time was as long as 7～8 hours, electrophoresis zone was wide and the distinguishability was low. Conclusion The new method improve the electrophoresis speed greatly, the effect of separation is good, and the results are accurate and reliable, which can truly reflect the content of product F(ab')2 and also determined the content scope of the aggregates, polymers, Fab, Fc fragments and small MW impurities in products which have been digested by gastric enzyme. The test result shows that the improved method is much better than the former one.
【Key words】 antitoxin；F(ab')2；electrophoresis
精制白喉、破伤风、气性坏疽、肉毒抗毒素类制品均分别由各该类抗毒素的马血浆经胃酶消化后提纯制得的液体或冻干抗毒素球蛋白制剂，分别用于各相应疾病的预防和治疗。抗毒素免疫血浆在胃酶的消化下，IgG分子被切割为F(ab')2和Fc两个片段，不具生物学特性的又不耐热的Fc段经加温变性而除去，留下的即为具有生物学特性且能中和相应毒素的抗毒素F(ab')2［1］，制品中完整IgG的存在，会导致病人对外来蛋白的敏感性，因此，F(ab')2含量检测准确与否，直接关系到评价生产工艺及制品质量的好坏，F(ab')2检测方法的改进对生产工艺的指导作用不可忽视，建立更加有效的F(ab')2检测方法，客观、准确地评价生产工艺及产品质量，是抗毒素类制品质量控制的有效方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器和设备 DYY-Ⅲ电泳仪一套(垂直板型);UMAX Powerlook 2100XL型扫描仪。
1.1.2 试剂 原方法试剂见2005版《中华人民共和国药典》三部附录Ⅷ F。改良法试剂：30%丙烯酰胺溶液：取丙烯胺29g，甲叉双丙烯酰胺1g, 加水使溶解成100ml；分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris pH 8.8 溶液）：取Tris 18.17g，去离子水溶解，浓盐酸调pH值至8.8，加水定容至100ml；浓缩胶缓冲液（1mol/L Tris pH 6.8 溶液）：取Tris 12.11g，去离子水溶解，浓盐酸调pH值至6.8，加水定容至100ml；10% 过硫酸铵：取过硫酸铵1g，去离子水定容至10 ml；10% SDS：取 SDS 10g，去离子水定容至100 ml；Tris-甘氨酸电泳缓冲液：取 Tris15.1g，甘氨酸94g，10% SDS 50ml，去离子水定容至1000ml，电泳时5倍稀释使用。样品缓冲液：取 4% SDS 0.4ml，20%甘油2ml，用Tris（pH 6.8）定容至10ml；电泳染色液：取考马斯亮蓝R-250 1.25g，乙醇250ml，冰醋酸100ml，去离子水定容至500 ml；电泳脱色液：取乙醇200ml，冰醋酸100ml，去离子水定容至1000ml。
1.1.3 方法 原方法见2005版《中华人民共和国药典》三部附录Ⅷ F。改良法: 10%分离胶、5%浓缩胶配制见表1、表2，聚合30min左右。表1 10%分离胶配制 表2 5%浓缩胶配制
1.2 供试品处理 稀释供试品约2mg/ml后，取50μl，加样品缓冲液50μl，混匀后100℃水浴加热。上样：每一孔内加入经处理的供试品25μl。电泳：采用80V垂直恒压电泳，待溴酚蓝电泳至底部时停止电泳。染色：将凝胶放入染色液中染色。脱色：将凝胶放入脱色液中平缓摇动4～8h，期间应更换脱色液3～4次。凝胶扫描分析：脱色充分后，用凝胶扫描系统对凝胶进行拍照，用软件分析F(ab')2和各杂带的含量。
1.3 统计学分析 采用配对t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 两种方法检测破伤风抗毒素F(ab')2含量凝胶分离结果比较 见图1，图2。
图1、图2分别为10批制品分别用原方法和改良法凝胶分离的结果。从图中可以看出：相同的样品在不同方法下的分离结果不同，原方法分离模糊，电泳区带宽，分辨率低；改良法分离清晰，电泳区带窄，分辨率高［4］。图1原方法凝胶分离结果 图2改良法凝胶分离结果
2.2 原方法与改良法凝胶扫描结果对比 见图3，图4。图3、图4分别为原方法、改良法凝胶扫描结果。从图中可以看出：同一样品在不同方法下的分离效果不同，导致其扫描结果不同。原方法显示除过F(ab')2峰的杂峰数目少但含量高, F(ab')2百分含量相对较低；改良法则显示除过F(ab')2峰的杂峰数目多，杂峰含量低, F(ab')2百分含量相对较高。图3 原方法凝胶扫描结果 图4 改良法凝胶扫描结果2.3 原方法和改良法 检测的F(ab')2含量结果的比较见表1。
表1为采用原方法和改良法分别对15批破伤风抗毒素进行检测，每一样品做3次，每次做双份，检测结果显示：原方法检测结果普遍低于改良法检测结果。对两种方法进行统计学分析，可以得出，两种方法结果差异有统计学意义（t=16.78 t(14,0.05)= 2.145,P＜0.05）。表1原方法和改良法检测的F(ab')2含量结果的比较（略）
3 结论
改良法能够真实反映制品的F(ab')2含量，同时也能准确确定血浆经过胃酶消化正常生产制品中含有不同分子量的聚集体、聚合体、Fab、Fc片段以及小分子量杂质及其含量范围，实验结果表明改良法优于原F(ab')2测定方法。
4 讨论
用2005版《中华人民共和国药典》三部中F(ab')2测定方法检测的F(ab')2含量，其检测结果普遍低于用中检所血清室提供的方法检测的F(ab')2含量，而改良法由于使用了浓缩胶，使得样品分离清晰，电泳区带窄，分辨率高，因此，改良法更能客观、准确的地评价产品质量，其分离结果更为真实，分析结果更为可靠；同时，改良法由于电泳时间大大缩短，使得样品分析时间缩短，这样，更便于实际工作使用，提高工作效率。另外，15批破伤风抗毒素检测结果还显示：分离区带中无IgG条带显现，凝胶扫描图谱中也没有IgG峰出现。由此说明免疫血浆经过胃酶将IgG彻底消化为F(ab')2、Fab、Fc片段以及小分子量多肽，经过纯化后的制品对人体更为安全，同时也说明现行生产工艺较为安全可靠，改良法已被2010版《中华人民共和国药典》定为检测F(ab')2含量的法定方法。
【参考文献】
1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（三部）.北京：化学工业出版社，2005:附录44.
2 赵铠，章以浩，李河民.医学生物制品学，第2版.北京：人民卫生出版社，2007:1144.
3 杨树勤.卫生统计学.北京：人民卫生出版社，1985.
4 郭尧君.蛋白质电泳实验技术, 第2版.北京：科学出版社，2005.