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【摘要】 本文以鲢鱼为原料，采用五种不同复合蛋白酶进行酶解，综合研究了复合生物酶酶量、酶解时间、pH、酶解温度等对鲢鱼蛋白酶解降血压肽ACE活性抑制效果的影响及其分子量特征。结果表明,复合酶P1具有最佳的酶解效果。 其最佳条件为: 酶量25Iu/ml;酶解时间2h;pH7.0;酶解温度60℃。此时ACE抑制率为88.08%。 并通过高效液相色谱分析了降血压肽的分子量组成及比例，结果表明：鲢鱼蛋白酶解降血压肽的分子量在1539Dal以下，十肽以下的短肽类物质占50.34%，其对降血压肽的活性影响显著。
【关键词】 鲢鱼;酶解;降血压肽;ACE抑制活性
Study on manufacture of enzymolyzed antihypertensive peptide abstracted from silver carp
WU Jin-chao.Second Institute of Oceanography, State Oceanic Administration,Hangzhou 310012,China
【Abstract】 This paper deals with the effects of enzyme concentration, hydrolysis temperature, pH and hydrolysis duration of 5 different complex enzymes on the ACE inhibitory activity of antihypertensive peptide abstracted from silver carp. The results are as follows: enzyme P1 has the best hydrolysis result. The suitable hydrolysis conditions of this certain complex enzyme are given in enzyme concentration of 25Iu/ml, hydrolysis duration of 2hrs, pH of 7.0, hydrolysis temperature of 60℃, and the ACE inhibitory ratio is 88.08% .Then the molecular weight component and percent is determined by HPLC, the result is, the molecular weight range of antihypertensive peptide is below 1539 Dal, and the short peptides below decapeptide take up 50.34%，which have important effect on the ACE inhibitory activities.
【Key words】 silver carp; enzymolysis ; antihypertensive peptide ;ACE inhibitory activity
研究表明，在原发性高血压中，肾素-血管紧张素这一作用体系是其中最重要的一个因素，在该体系中，ACE(Angiotensin―converting enzyme),即血管紧张素转换酶(EC.3.4.15.1)的作用最为重要，不具有生理活性的Ang I(血管紧张素I)经过血管紧张素转换酶的作用，转换成具有收缩血管壁平滑肌作用的Ang Ⅱ(血管紧张素Ⅱ)，导致血压上升;同时，具有扩张血管平滑肌从而使血压下降的血管舒缓激肽又会在血管紧张素转换酶的作用下被分解而失去活性，从而加剧血压上升[1] 。酶解降血压肽实质是一种对ACE酶活性具有抑制作用的生物活性肽。通过它的作用，可使ACE酶活性受到抑制，从而减少或阻碍有升高血压作用的血管紧张素Ⅱ的生成，并抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，因此起到降血压的作用[2]。近年来，国际上报道有以牛奶、乳酪、大豆、鱼肉、蔬菜、小麦蛋白等食物为原料，经蛋白酶酶解产生了具有较好ACE抑制活性的酶解降血压肽[3～10]。Eiji等水解了12种食物蛋白进一步研究发现，从鱼肉、虾、蟹等水产动物蛋白中制得的酶解降血压肽其ACE抑制活性优于其他食物性蛋白[11]。本研究采用五种复合生物酶酶解鲢鱼蛋白，制取降血压肽，综合探讨复合生物酶酶量、酶解时间、pH、酶解温度等对鲢鱼蛋白酶解降血压肽ACE活性抑制效果的影响。分析了酶解的最佳条件，并对其分子量组成进行了分析，以期为鲢鱼等淡水鱼类开发降血压肽提供探索。
1 材料与方法
1.1 实验材料 鲢鱼(市售)。将其剖杀，洗净，脱脂，取净肉绞碎成肉末，以备酶解之用。
1.2 试剂 参照有关资料和前期研究成果[7～10]，酶解制备降血压肽，以碱性蛋白酶效果较佳，本项目分别选取一组酸性蛋白酶复合酶、一组中性蛋白酶复合酶、三组碱性蛋白酶复合酶， 研究各组复合生物酶的酶解效果。酸性蛋白酶复合酶(胃蛋白酶50%、宇佐美曲霉50%)P4;中性蛋白酶复合酶(枯草杆菌蛋白酶50%、木瓜蛋白酶50%)P3;碱性蛋白酶复合酶(地衣芽孢杆菌蛋白酶、碱性复合蛋白酶)分别按25%：75%，50%：50%，75%：25%的比例组成复合蛋白酶P1、P2、P5 ;以备实验之用。其组分均购自上海生物化学试剂公司。ACE标准样品 Sigma试剂。其他相关试剂均为优级纯。
1.3 实验方法
1.3.1 最佳酶解条件确定 利用上述五组复合蛋白酶配方，在不同酶解条件下对鲢鱼蛋白进行酶解，采取Uniform Design(均匀设计)方案[12]，研究不同酶量、酶解时间、酶解温度、pH等四大因素对各酶酶解效果的影响。
1.3.2 酶解样品ACE抑制活性的分析 用紫外分光光度法分析不同酶解条件下制备的酶解降血压肽对应的ACE抑制活性。有关步骤参照Cushman[13]和后经Toshiro[14]改进的方法进行。
将反应液(K3PO4 100mM, pH8.3; NaCl 300mM; HHL 5mM)量取0.25ml，加入试管。分别加入降血压肽液1ml(对照组加蒸馏水)。取0.15ml ACE液(5mM)于反应液中，37℃水浴保温30min。加入0.25ml 1N浓度的HCl充分搅拌以终止反应。加入1.5ml醋酸乙酯，涡轮搅拌，以萃取反应生成的马尿酸，收集上清液。将上清液于100℃水浴加热约20min，以蒸发掉醋酸乙酯，然后加入3ml蒸馏水，充分振荡。将此溶液于228nm下用紫外分光光度计测定其吸光值。将各酶解液反应值与空白样品对照，分析所得酶解降压肽的ACE抑制率。
计算公式为：A─A (control) A×100%。
1.3.3 高效液相色谱法测分子量 利用标准曲线法。
1.3.3.1 色谱条件 Waters 600 高效液相色谱仪; 色谱柱:TSK gel 2000; 流动相: V(乙腈): V(水): V(三氟乙酸)=45:55:0.1, 检测波长 220nm, 体积流量0.5ml/min, 柱温30℃。
1.3.3.2 相对分子质量校正曲线所用标准品 细胞色素C(MW 12500)，抑肽酶(MW 6500)，杆菌酶(MW 1450)，乙氨酸-2-乙氨酸-2-酪氨酸-2-精氨酸(MW 451)，乙氨酸-2-乙氨酸-2-乙氨酸(MW 189)。
取酶解降血压肽上清液滤纸过滤，再用0.22μm微孔滤膜过滤，然后以供高效液相色谱进样。
1.4 实验步骤 各取鲢鱼肉末100g，加1.5倍水蒸煮10min，冷却，按均匀实验设计加入一定量的酶液, 于特定温度、pH下酶解，搅拌(20rpm)，酶解完成后升温灭酶(95℃、10min)，再离心分离(4000rpm、10min)，取上清液定容至150ml待测。
将所得降血压肽液用Sephadex G-25柱层析纯化，利用20mmol/L HCl ( pH 7.5)为洗脱液, 收集各样品以备分析检测之用。
2 结果与分析
2.1 复合酶P1实验结果 按照上述实验设计和步骤，各酶在不同作用条件下处理的酶解液其ACE抑制率分别如下，具体见表1及以下结果。 对于P1，对以上结果进行回归分析，所得回归方程为:Y=70.464-1.195X1+15.299X2+11.971X3-4.310X22+0.194 X1X2-0.141X3X4表1 复合酶P1实验结果 根据方程分析最佳的ACE抑制活性为90.23%，但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制率为86.55%, 所以NO1为最佳条件。其ACE抑制率为88.08%，对应的最佳实验条件为： 酶量： 25 Iu/ml;酶解时间： 2h;pH 7.0;酶解温度： 60℃。依次进行P2～P5的酶解实验，分析不同酶种及酶解条件对降血压肽活性影响，具体结果略。对于P2，对其结果进行回归分析，所得回归方程为:Y =-33.465+1.174X1+52.417X2-29.396X3-3.887X22-0.239X1X2+0.409X3X4根据方程分析最佳的ACE抑制活性为71.35%，但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制率为72.55%, 对应的最佳实验条件为： 酶量： 80Iu/ml;酶解时间5h;pH7.3;酶解温度60℃. 对于P3，对其结果进行回归分析，所得回归方程为:Y =50.653-0.53X1+0.233X2+0.007683 X12-0.02238X42-0.192 X1X3+0.380X3X4根据方程分析最佳的ACE抑制活性为65.35%，但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制活性为67.33%，其最佳实验条件为NO2 实验方案。ACE抑制率为67.33%，对应的最佳实验条件为：酶量： 50 Iu/ml;酶解时间： 4h;pH 8.0;酶解温度： 55℃。 于P4，对其结果进行回归分析，所得回归方程为: Y=-11.515+0.407X1-3.927X2-0.00254X12-3.887X22+0.01932X42+0.113X1X3-0.280X3X4根据方程分析最佳的ACE抑制活性为52.32%，但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制活性为48.55%, 对应的最佳实验条件为： 酶量：100Iu/ml;酶解时间：3h;pH5.3, 酶解温度： 55℃。对于P5，对其结果进行回归分析，所得回归方程为:Y=2.766+0.733X1-6.832X2-0.857X3+0.917X22-0.05007X1X2+0.02538X3X4根据方程分析最佳的ACE抑制活性为70.28%，但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制活性为68.51%, 因此对应的最佳实验条件为：酶量： 160 Iu/ml;酶解时间： 6.5h; pH 6.4, 酶解温度： 58℃。由以上结果可知，P1蛋白酶具有较好的酶解效果，其得率为15.65%(湿重)。在其最佳酶解条件下，制备一定量的降血压肽样品，分析其分子量组成及比例，并对比其与鲢鱼蛋白分子量组成的不同。
2.2 标准蛋白、酶解降血压肽及鲢鱼蛋白的高效液相图谱 见图1～3及其分子量组成比例见表2。图1 标准蛋白的高效液相图谱Fig.1 HPLC spectrum of normal protein图2 鲢鱼蛋白高效液相图谱Fig.2 HPLC spectrum of silver carp protein图3 酶解降血压肽高效液相图谱Fig.3 HPLC spectrum of antihypertensive peptide表2 鲢鱼蛋白及酶解降血压肽分子量组成及比例
3 讨论
3.1 复合蛋白酶可有效利用各酶的协同作用 从国内外大量相关研究成果看，通过酶解获得的降血压肽对ACE有抑制作用的肽类其种类较为复杂，其实质是多种活性肽的混合体。而目前大多数研究以单一酶种进行酶解，由于单一蛋白酶酶切作用位点的限制，其酶解效果会受到较大影响。采用复合蛋白酶进行酶解，可有效利用各酶的协同作用，提高酶解效果和得率，从对ACE的抑制率来看，有关实验数据也证明了这一点。
3.2 酶解效果比较 由实验结果可知，对于鲢鱼蛋白酶解降血压肽的制备，总的来说，碱性蛋白酶如P1、P2、P5的酶解效果要优于酸性蛋白酶如P4和中性蛋白酶P3，有关原因尚须进一步探讨。其中尤以P1的酶解效果最佳，最高的ACE抑制率可达88.08%，同时其具有酶量小，酶解时间短的优点。
3.3 具体分析P1的酶解情况 随着酶量的增加和酶解时间的延长，其酶解程度增加，但其ACE抑制率下降。这是因为随着酶解程度提高，部分具有ACE抑制活性的短肽被酶解成氨基酸或其活性基团被破坏，从而导致其ACE抑制活性下降。这一点与Kim通过牛皮胶制备酶解降血压肽的研究得到的结论相吻合，即并非酶解程度最大时其活性最好[15]。
3.4 分析降血压肽的分子量 从图2，图3，及表2可知，鲢鱼蛋白分子量较大，其分子量在80000Dal以上的部分占30%以上，降血压肽则分子量普遍较低，分子量范围在1539 Dal以内，其中十肽以下短肽占50.34%，这与其降压活性密切相关。与鲢鱼蛋白的分子量组成相比(其十肽以下短肽占18.5%)，说明酶解效果显著。这一结果与Eiji等的研究结果相吻合，他们水解了12种食物蛋白制取降压肽，研究发现，短肽类(含2～4个氨基酸残基)比稍长肽链(含10～12个氨基酸残基)有更好的ACE抑制活性[16] 。
据报道，我国目前有高血压患者1亿多人，每年将近一百万人因高血压而死亡，而且随着生活水平的提高和社会节奏的不断加快，高血压患者有年轻化趋势且数量正逐年增加;这一严峻形势引起了社会各方的共同关注。但另一方面，作为世界第一水产大国，我国的海洋捕捞和淡水养殖一直处于世界前列，但水产品深加工水平却相当落后，主要还停留在较低层次的产品加工，产品的附加值较低且市场前景有限。鉴于以上情况，加大从海水及淡水养殖的低值鱼中研制开发具有较高降血压活性的酶解降血压肽，则对于缓解以上问题意义重大。
本项目对于利用水产蛋白进行酶解降血压肽的研究开发，不仅对其酶解条件进行了研究，同时对酶解降血压肽进行了纯化、结构分析，并利用动物实验证实了有关产品具有较好的降血压功能，其他内容将作另文发表。
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