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【摘要】 血栓是血液成分在血液循环中于血管或心脏内膜表面形成的血液凝块或沉积物，导致循环障碍。噬菌体展示技术是将编码外源编码序列插入改建噬菌体载体的外壳蛋白基因中，以融合形式共同表达与噬菌体表面的一种技术，是一种高效的筛选体系。本文简介了相关方面的技术运用与研究进展。
【关键词】 血栓与止血;噬菌体展示技术;血栓形成;综述
【Abstract】 Thrombosis is a blood component which formed blood clots or sediment on the surface of the intima in blood vessels or the heart in the blood circulation, leading to circulatory disturbance. Phage display technology is to insert the coding sequence encoding conversion of exogenous phage coat protein gene carrier to form a common expression of fusion phage of a technology, is a highly efficient screening system. This paper describes the use of related technical and research progress.
【Key words】 thrombosis and haemostasis;phage display;thrombophilia;review
血栓、止血与临床各科之间的联系和渗透都非常紧密，从基因水平阐明那些遗传性和先天性，甚至某些获得性血栓和出血疾病的发生发展机制已经成为当今该领域的研究潮流。噬菌体展示技术将外源蛋白融合表达于噬菌体颗粒表面，展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性。这无疑为血栓与止血学的深入研究提供了强大的工具。
1 噬菌体展示技术的原理及在血栓与止血方面应用特点概述
1.1 噬菌体展示技术的原理
噬菌体作为一种病毒，具有侵入宿主细胞，表达自身衣壳蛋白进行自我复制的能力。利用噬菌体衣壳蛋白基因的特点将编码外源多肽或蛋白质的基因与噬菌体衣壳蛋白基因融合，从而使需要表达的多肽或蛋白质以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面，而被展示的多肽可保持相对的空间独立性和生物学活性[2]。再通过亲和富集等方法筛选表达特异的蛋白或多肽的噬菌体，最后通过宿主菌把特异性蛋白或多肽表达出来。
1.2 在血栓与止血方面的应用特点
由于该技术最大的优点就是直接将基因型和表型，分子结合活性与噬菌体的可扩增性联系到一起，通过配体的特异性亲和力或与特异性酶结合剪切性，获得所需要的多肽或蛋白。因此，它在血栓与止血领域中非常适用于凝血系统与抗凝系统的相关蛋白间相互作用研究、相关因子的抗原分析和抗体制备、多肽类抗凝药与止血药的研发及血栓与出血性疾病的临床早期实验室诊断技术等方面的广泛研究与应用。
2 噬菌体展示技术在出血性疾病中的应用与发展
2.1 关于血小板的膜受体、抗体及其相关疾病的研究
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是最常见的自身免疫性出血疾病，但分子级的相关自身抗体知道的却很少。因此，ITP的诊断性试验和治疗缺乏特异性[3]。为了避免传统的B细胞无限增值法导致的技术缺陷Jessica H. Roark[4]等克隆全部组基因，克隆了血小板自身抗体;并检测了免疫球蛋白基因的用法，克隆形成能力和抗体特异性。噬菌体展示文库是由2个慢性ITP病人的脾细胞建成，并且细胞表面竞争性筛选被用来分离几组独特的lgG血小板特异性自身抗体。综合研究结果表明：由遗传限制性和高特异性轻重链产物的结合而纯系扩张的B细胞产生的多种多样血小板抗体决定着与ITP相关的血小板活性抗体的发展。ADAMTS13富半胱氨酸域/间隔域含有一段主要与获得性TTP(血栓性血小板减少性紫癜Thrombotic Thrombocytopenic Purpura)病人抗体结合的位点。为了研究这种抗体的异质性对富半胱氨酸域的反应，B.M.LUKEN[5]等构建了V基因免疫球蛋白噬菌体库用来从一位获得性TTP病人的免疫球蛋白谱中分离单克隆抗ADAMTS13抗体。连接可变区重链和轻链，表达成单链抗体与含有脱整联蛋白/血小板反应素1/富半胱氨酸域/间隔域的ADAMTS13片段进行结合筛选。分析得到的单链抗体揭示出多功能B细胞克隆产生的抗体直接作用于间隔域是可行的，同时表明具有相似抗原特异性的抗体也存在于其他获得性TTP病人中。血小板膜受体的单克隆抗体已经被广泛地应用于分析受体结构和功能。人功能阻断性抗体已经被用于抗血小板药物的研发。Y.Hagay[6]等从用丝状噬菌体展示的单链抗体库中通过筛选全部的血小板分离了人相关单克隆抗体。他们得到八条不同的与血小板结合的抗原。有两条可以被纯化作为scFV(单链抗体)，并且它们相互竞争结合到完整的血小板上。这些数据表明了从人scFvs噬菌体库用全血小板筛选可以用于分离功能性抗血小板GPIb抗体，这将有利于发展新的血栓治疗与诊断的策略。
2.2 在各型血友病中的应用
在获得性血友病中与VⅢ因子凝结的多克隆自身抗体(阻断剂)被制造出来了。Christoph Kessel[7]等用噬菌体随机肽库在病人的血浆中筛选模拟表位小肽以鉴定阻断剂抗原表位。获得的肽段序列与FVⅢ上A2和A1区域构象结合。随着更多的病人标本被筛选分析，更多的FVⅢ的免疫决定域被知道。这不仅可用于获得性血友病，同样也可与A型血友病相比照。Edward N. van den Brink等用V基因噬菌体展示方法对人抗FVⅢ抗体进行分子分析，鉴别出一段紧接着A2区酸性区域的新抗原表位[8], 也用该方法从VH1种系基因中找到了人对FVⅢ的C2区特异性抗体[9]。
3 噬菌体展示技术在血栓形成与血栓性疾病中的应用与发展
β3-整合蛋白参与经由αⅡbβ3[glycoprotein (GP)IIb-GPIIIa]的血小板积聚，并在血管再生中是经由内皮αvβ3。有抗聚集和促血管生长作用的交叉反应配体(这两种反应在外周血管疾病中有令人满意的效果)。为了研究体内外两条人重组Fab片段的抗聚集和促血管生长作用，特别是β3-整合蛋白，R. ESCHER[10]等通过噬菌体展示技术获得重组Fab片段。观察到了在无血小板活性条件下，两条人Fab自身抗体片段与一段完整GPIIb-GPIIIa受体结合的特异性和高亲和力。剂量依赖性纤维蛋白原与GPIIb-GPIIIa结合及血小板聚集被完全抑制了。找到了第一条有全部抗聚集性质的完全人抗GPIIb-GPIIIa的Fab片段，并且不激活血小板。这条片段的研究获得可能代表了一种新的工具对外周血管血栓病的研究。
血小板糖蛋白Ibα与VWF的相互作用是血小板黏附的一个早期重要反应。血小板与胶原结合的直接方式是经过胶原的α2β1受体，糖蛋白IV和VI。间接的方式是在胶原与血小板vWF受体(GPIb/IX/V复合物)间vWF形成一座桥。这两种方式都是维持血小板在高剪切力下粘附性所必需的[11]。Paul A. McEwan[12]等报道了一种介于GpIbα和一强力阻滞肽间复合物的结构。这条肽段局限于与vWF结合域重叠。它有效地起抑制作用是通过稳定一段在vWF结合域上形成扩大的β发夹结构的调节环的可交替α螺旋结构。这段结构明确了一条先前未被识别出的GPIbα结合域并且表现出了一种可发展作用于GPIbα-vWF变构作用的抗血小板靶向制剂。镰刀红细胞对血管内皮细胞及皮下基质的高粘附性可能在镰刀红细胞血管闭塞的发病机制中起到重要作用。为了获得与凝血酶敏感蛋白(TSP)结合的抗体，Nicholas A.Watkins[13]等筛选了展示在丝状噬菌体表面的人scFVs高多样性文库。经过三轮的淘选，6条能与纯化TSP结合的独特scFVs被用ELISA分离出来。这为镰刀红细胞与TSP黏附时这段区域的作用提供了依据。
4 噬菌体展示技术在血栓与止血预防与治疗中的应用与发展
(胶原)Collagen-vWF-GPIb/IX/V轴在血栓形成中起到很重要的作用，它表现出一种具有可开发前景的新型抗凝药的目标。T.SZANTO等[14]用一随机直线型七肽库来筛选鉴定了可能干扰vWF-collagen绑定的小片段。他们得到了一个和vWF具有特异的并且有剂量依赖性的结合方式的克隆体。继续研究证明了这是第一条与vWFc区结合的拮抗多肽，并能在高剪切力下抑制血小板的黏附与聚集;这条肽链有望开发为可口服的主导抗凝产品。像很多其他酶一样，属于凝血酶/胰蛋白酶家族的成员，存在与特定的酶激活段结合时的特异性选择问题。因此，这类抑制性药物就可能会增加不良药物和高副作用的风险。Dennis[15]等通过天然肽的噬菌体库找到了抗凝肽段。它与VIIa因子激活段明显区别的一段牢固结合。这种展示也许是一类可以解决这类问题的方法。肝素被广泛用作抗凝剂。Els M. A. van de Westerlo[16]等运用噬菌体展示技术筛选了半合成scFV文库no.1，获得了19条独特的人抗肝素抗体。选择半合成文库的优势在于GAGs包括肝素很大程度上没有免疫原性，因此使用平常抗体产生技术一般很难成功。抗体在肥大细胞内是有与肝素反应活性的。噬菌体抗体库的筛选提供了独特的工具用来研究肝素及相关GAGs结构、位点和功能;并且有的结果可用作阻断剂使用。
5 噬菌体展示技术在血栓与止血实验室检查中的应用与发展
HIV-1相关血小板减少症(HIV-1-ITP)是常见的HIV-1感染的并发症。Klaus Koefoed[17]等用从由3个HIV-1-ITP病人免疫血清构建的免疫球蛋白G噬菌体文库，分离出一大组经过未固定血小板筛选的人单克隆抗体。由于暴露了的talin-H免疫显性表位可作为疾病相关进程的结果。talin-H抗体和相关的免疫复合物会对HIV-1-ITP的诊断提供价值。
6 噬菌体展示技术在血栓与止血方面研究应用的展望
噬菌体肽库技术将传统的表位研究大大简化。将抗体作为受体暴露于肽库中,筛选并分析所得到的能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列,再经过与抗原序列相比较,也就得到了抗原决定簇的定位。该方法用于定位VWF、受损的血小板及特异性抗FVⅢ抗体的抗原表位，得到特异性小肽分子与患者体内的抗体相结合，就可以快速、高特异性地诊断相关疾病或中和某些抗体，用于治疗免疫性疾病[18]。虽然目前该类诊断与治疗试剂用于临床还较少，但如上所述，研究者们正在以分子水平不断开发具有普遍诊断和治疗价值的免疫优势抗原表位。
噬菌体抗体库可不经过免疫直接利用抗原筛库，其容量大，筛选能力强，可直接克隆得到抗体基因使得人源化单抗容易制备[19]。血小板的黏附、聚集、释放是血栓形成的重要环节。拮抗血小板膜糖蛋白对防治血栓性疾病具有重要意义。 虽然噬菌体技术不能进行氨基酸的修饰，只能合成 L型氨基酸，不能对蛋白质进行糖基化加工，密码子表达偏性，库容量限制[20]，较长的外源肽段易随机折叠等许多不足，但相信随着该技术的不断发展和自我完善，其在血栓与止血领域的运用价值也会不断增加，诊断治疗性产品最终会走向临床。
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