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首页医源资料库在线期刊中华医学研究杂志2011年第11卷第2期

H5N1型禽流感疫苗研发最新进展

来源:中华医学研究杂志
摘要:【摘要】H5N1是A型流感病毒的一个亚型,也是近年来引起禽流感暴发的高致病性禽流感病毒。在亚太地区肆虐的H5N1型禽流感病毒存在接触传染到人的病例,引起了研究人员的高度关注。疫苗免疫是预防高致病性禽流感的重要防线,因此研制高效、安全、实用的禽流感疫苗迫在眉睫,成为世界养禽业关注的焦点。目前广泛应用的......

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【摘要】  H5N1是A型流感病毒的一个亚型,也是近年来引起禽流感暴发的高致病性禽流感病毒。在亚太地区肆虐的H5N1型禽流感病毒存在接触传染到人的病例,引起了研究人员的高度关注。疫苗免疫是预防高致病性禽流感的重要防线,因此研制高效、安全、实用的禽流感疫苗迫在眉睫,成为世界养禽业关注的焦点。目前广泛应用的安全高效的H5N1亚型禽流感病毒的常规灭活疫苗存在着自身的缺点,因此新型疫苗的研发就显得尤为重要。流感病毒反向遗传操作系统的建立为新型流感疫苗的研制提供了有力工具。从1997年首例人感染H5N1病毒以来,经过十几年的不断探索,流感疫苗取得了显著成就。本文就目前国内外H5N1亚型禽流感病毒疫苗的开发进展做一综述。

【关键词】  H5N1禽流感;疫苗;反向遗传技术;最新进展

 自1878年,首次报道禽流感病例以来,该病毒在全球范围内扩散。1997年香港爆发的H5N1型高致病性禽流感是首次出现的高致病性禽流感感染人类并造成死亡的病例[1]。随后,H5N1在东南亚地区蔓延扩散,给家禽养殖业造成巨大损失,并且威胁到了人类社会的公共健康。

  有效的疫苗接种是保护人群及其他易感动物免受流感攻击的主要医疗干预手段。由于人类尚缺乏针对H5N1高致病性禽流感病毒的免疫力,在可预见病毒流行的条件下,如果能够快速足量提供疫苗,就可以降低发病率和死亡率。我国在应对高致病性禽流感的防制上,主要采取灭活疫苗免疫的策略,并取得了较好的控制效果。因此,禽流感疫苗的开发和生产则成为预防禽流感大流行的重要举措。目前使用的疫苗包括灭活疫苗、基因工程活疫苗和DNA疫苗[2]。

  1 H5N1亚型禽流感病毒的分子生物学特点

  高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。根据病毒核心外的两种抗原即血凝素(H)与神经氨酸酶(N)的不同可区分为不同亚型,H5N1就是A型流感病毒的一个亚型,也是近年来引起禽流感暴发的高致病性禽流感病毒。禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)最显著的生物学特性就是亚型众多,变异频繁,其分子机制涉及点突变引起的抗原漂移和不同亚型毒株同源重组产生新亚型所引起的抗原转变。目前已知AIV有15个HA亚型和9个NA亚型。

  1.1 病毒的基因组结构

  禽流感病毒基因组由8个线状的单链负义RNA片段组成,编码10种病毒蛋白[3],分别为聚合酶(PB2、PB1、PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1、M2)、非结构蛋白(NS1、NS2)。通过对其毒株8个片段的测序发现,它们存在一些共同的特点,即所有基因片段的5′端前13个核苷酸均相同,序列为GGAACAAAGAUGAppp5′,3′端也有12个高度保守的核苷酸,序列为3′HO-UCGUUUUCGUCC-5',在这些共有序列中,可部分互补,形成锅柄环状结构,该结构是病毒RNA聚合酶结合所必需的核苷酸识别位点。

  1.2 血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)的结构与功能

  血凝素蛋白是病毒表面的主要糖蛋白,也是病毒最主要的表面抗原,可以诱生保护性抗体及细胞免疫,是当前疫苗的主要成分[4]。HA分子通常有6~10个糖基化位点,4个结构域,即信号肽、胞浆域、跨膜域、胞外域,是流感病毒所有蛋白中最重要的一个,具有凝集多种动物红细胞的性质。

  HA蛋白包括HA1蛋白(47kD)和HA2蛋白(29kD)。HA1上含有HA最主要的5个抗原位点,也是禽流感病毒和细胞表面特异性受体结合的主要位点[5,6]。HA1的变异是导致禽流感病毒发生抗原漂移和抗原转变的主要原因[7,8]。研究表明HA1上的某个氨基酸变异可以直接导致禽流感病毒由禽类向人类传播[9]。

  HA与病毒的毒力甚为密切相关,是病毒吸附于易感细胞表面受体的工具,其能否被裂解为蛋白HP(rHA1)和MP(rHA2)是感染细胞的先决条件[10]。

  1.3 非结构蛋白(nonstructural protein,NS)的结构与功能

  NS为非结构蛋白,由第八节段NS基因编码,编码2种病毒非结构蛋白NS1和NS2[11]。流感病毒NS1蛋白有两个比较重要的功能区:A区为氨基酸的RNA结合区,NS1蛋白可通过此区与不同种类的RNA相结合,B区为分子羧基端的效应区,此区可与宿主细胞核蛋白相互作用,抑制细胞核mRNA的运输[12,13]。两种蛋白大量存在于感染的细胞中,NS1主要在核内,NS2主要在胞浆内,在病毒粒子内不存在这两种蛋白成分[14]。NS1相对分子质量约为26kDa,在病毒感染的细胞中含量丰富,病毒复制早期即有NS1蛋白的大量表达,提示NS1蛋白在病毒复制及病毒早期抵抗机体的抗病毒免疫应答过程中具有重要作用[15,16],可以用此来鉴定区分自然感染与疫苗免疫的机体。

  2 H5N1型禽流感病毒基因HA在植物细胞中的表达

  植物具有成熟的遗传转化再生系统和完整的真核细胞表达系统,植物医药基因工程近几年来得到迅速发展,利用转基因植物生产药用蛋白的报道屡见不鲜。陈亮[17]等人则利用植物遗传转化技术,用农杆菌介导法将来自H5N1型高致病性禽流感病毒的HA基因转化烟草,成功地将目的基因整合到烟草基因组中,并得到表达,为植物源口服疫苗的生产奠定了基础。

  他们通过对HA基因片段的扩增,并将扩增的基因片段插入到双元载体pCAMBIA1301的Pst I位点,构建了质粒p1301H5N1,继而把质粒转入农杆菌,用改良叶圆盘法[18]将农杆菌转化烟草后,将无菌烟草苗叶片培养2天后,用含有羧苄青霉素和潮霉素的选择培养基筛选培养,采用PCR扩增、Southern分析、GUS组织化学染色和Western分析[19],检测外源基因在烟草中的表达。

  结果表明HA基因整合入烟草基因组中并且获得很高的转化率(>90%),而GUS组织化学染色、Western分析结果表明整合入烟草中的外源基因得到大量表达,表达的HA蛋白具有免疫原性。

  3 H5N1型禽流感病毒基因NS1在动物细胞中的表达

  杆状病毒表达系统具有宿主范围广、表达量高、后加工修饰系统完备、使用安全等优点被人们广泛应用。与原核表达的NS1蛋白相比,杆状病毒表达系统表达的NS1蛋白在翻译后能够更好地被加工和修饰,更接近天然的NS1蛋白,因此具有很好的免疫活性。刘明等[20]利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功表达了H5N1亚型AIV的NS1蛋白。他们将H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因片段插入到杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组转移载体pFastBac1-NS1,再将pFastBac1-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组转座子rBacmid-NS1,继而转染昆虫细胞,实现了NS1基因在昆虫细胞中的高效表达。由此获得的疫苗具有很好的安全性,并能够刺激机体产生足够的免疫力。经SDS-PAGE与Western blot分析,结果显示有特异性蛋白表达,并且表达的特异性蛋白与天然蛋白具有相似的免疫活性,ELISA检测显示表达的NS1蛋白具有很强的免疫原性和特异性。

  4 H5N1亚型禽流感病毒蛋白在微生物细胞中的表达

  4.1 H5N1禽流感病毒糖蛋白HA1在重组毕赤酵母中的表达

  毕赤酵母作为一种真核细胞生物,不仅生长迅速、操作简单,而且其醇氧化酶启动子可严格控制外源基因表达,通过对表达产物的后加工,使外源蛋白得到正确折叠和修饰,被广泛用于基因工程产品的生产。重组毕赤酵母基因工程的重要应用之一是利用高密度发酵分泌表达获得重组外源蛋白。

  杨坤宇等[21]利用重组毕赤酵母表达系统,通过分批补料培养方式,实现了HA1蛋白在毕赤酵母中的表达,并对高密度分泌发酵工艺进行了优化,在保证rHA1蛋白活性的基础上,使HA1蛋白的表达量达到了120mg/L。

  他们采用分批补料培养方法,对培养温度、诱导温度、补料方式、微量元素等影响菌体生长和产物表达的因素进行工艺优化。结果表明较低的培养温度有利于rHA1发酵菌种的生长,温度过高菌体易于衰老;高的诱导温度有利于提高生物量,而低的温度则有利于外源蛋白的分泌,适当的温度则可获得较高的单位分泌表达量,25℃为rHA1分泌发酵表达的最适诱导温度。

  甲醇诱导阶段是外源蛋白HA1表达阶段,甲醇作为碳源兼能源,诱导期的菌体生长与外源蛋白诱导表达过程受甲醇流加策略的影响。过低的甲醇浓度可能导致诱导表达的能量不足而降低表达量,过高的甲醇浓度又将抑制菌体的生长,甚至导致死亡,因此诱导过程中保持一定的甲醇浓度对菌体的生长和rHA1的表达有重要的意义[22~24]。他们对此阶段采用了三种不同的甲醇流加方式,并比较了三种诱导方式对外源基因表达的影响。结果表明,补入发酵液总体积0.5%的甲醇,初始碳源消耗完后开始以3ml/(L·h)速度流加甲醇,3h后将流速提高到6ml/(L·h),之后根据DO调节甲醇流加速度,并添加纯氧以维持DO在30%左右,这种诱导方式不仅缩短了发酵周期,还提高了目的蛋白的表达量。

  4.2 H5N1禽流感病毒蛋白NS1在大肠杆菌中的表达

  刘畅等[25]根据已经测得的NS基因序列,将NS1基因片段克隆到含T7强启动子的pET-32a(+)原核表达载体中,通过转化大肠杆菌BL21,继而37℃振荡培养2h至OD600为0.6,加IPTG至终浓度1mmol/L,继续培养6h收菌,实现了NS1融合蛋白的表达。

  5 反向遗传技术制备H5N1疫苗

  反向遗传技术是一个直接针对病毒基因的合理性步骤,它能够净化从非正式系统中获得的或是含有其他病原体的野生型病毒株,并且可以在质粒阶段除去HA基因中的致病性因素[26],因此成为目前获得流感病毒基因工程疫苗的有力手段并且被学术界和工业界等一致确认为制备大流行流感疫苗株的标准技术。利用反向遗传技术能迅速有效地从一个高致病性病毒株得到无致病性重组病毒株。

  Tian等[27]利用反向遗传技术处理病毒,随后用福尔马林灭活得到全病毒油乳剂灭活疫苗。该疫苗能为小鸡提供大约10个月的免疫保护,并且能使鹅和鸭产生的免疫性达6个月以上。他们从我国第一例H5N1高致病性禽流感病例中分离出GSGD/96病毒,从2004年的病例中分离出CKTJ/04和DKSH/04病毒,将病毒接种于10天龄的鸡胚中进行增殖。根据文献[28]构建质粒,通过在pCI质粒的CMV-Rib-Pol I-SV40多聚A信号处的Xba I位点中,插入Pol I启动子和质粒pPol I-Sap I-Rib的核酶序列片段构建双向转录质粒pBD。通过RT-PCR反应对GSGD/96中的HA和NA全长基因进行扩增,扩增产物插入到pBD的Sap I位点;用PCR反应,将HA裂解位点的氨基酸序列RERRRKKR↓GLF替换成RETRF↓GLF[29]。再将质粒转染Vero细胞,转染后的细胞接种10天龄的鸡胚,30℃48h后收获。通过鸡红细胞的血凝和血凝抑制实验对产物进行鉴定,最后获得了重组疫苗。

  研究表明,反向遗传技术可以在几周内制备出无致病性与高产的重配株,解决了大流行流感疫苗生产中的安全难题。

  6 展望

  开发疫苗最关键之处是要找到能够诱导保护性免疫反应的疫苗配方,2004年以来,世界各国研究机构纷纷研究不同配方疫苗,旨在通过探讨使用低抗原含量、添加佐剂等途径提高免疫原性,从而增加提供疫苗数量的可能性。在疫苗研制上,我国处于领先水平。我国人用禽流感疫苗的研究和开发已与全球同步,将为我国预防流感大流行提供重要的技术与物质储备。

  反向遗传学技术的诞生,为流感病毒新型疫苗的开发研究和生产提供了广阔的空间。利用现有的季节性流感疫苗生产技术,将为大流行爆发前提供更多疫苗储备,为应对全球流感大流行疫情爆发、控制疾病、保障人民群众的健康和社会的稳定发展提供比较充分的技术与物质保障。

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作者: 周韵娇作者单位:200240上海,复旦大学附属上海市第五 2013-2-26
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