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【摘要】 目的 观察6周持续游泳运动对大鼠海马cAMP表达的影响。方法 雄性SD大鼠30只,随机分为对照组(n=5)和持续运动组(n=25)。建立大鼠持续游泳运动模型，采用酶联接免疫吸附剂法，观察大鼠海马cAMP表达的变化,并用统计学软件进行数据分析。结果 运动后cAMP的浓度先下降后升高，在30min达到峰值随后又下降。大鼠海马cAMP浓度在即刻、120min、240min有所下降,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);运动后60min大鼠海马cAMP浓度达到最低值(P<0.01);运动后30min大鼠海马cAMP浓度达到峰值，与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。 结论 6周持续游泳运动对大鼠海马cAMP的表达有影响，具有时效性。
【关键词】 持续运动;大鼠;海马;第二信使cAMP
【Abstract】 Objective To observe the six weeks of sustained swimming on hippocampal expression of cAMP. Methods 30 male SD rats were randomly divided into control group (n=5) and the continued exercise group (n=25 rats). To establish a rat model of continuous swimming, the use of enzyme linked immunosorbent method to observe the expression of hippocampal changes in cAMP, and statistical data analysis software. Results After exercise the concentration of cAMP increased in the first 30min after the decline in peak and then decline. cAMP concentration in rat hippocampal instantly, 120min, 240min decrease compared with the control group were significantly different (P<0.05); after movement of 60min the cAMP concentration in rat hippocampus reached the minimum value (P<0.01); after movement of 30 min the concentration of cAMP in hippocampus reached peak, compared with the control group, there was no significant difference (P> 0.05). Conclusion Continuing six-week swimming exercise has influence on rat hippocampus the expression of cAMP, with timeliness.
【Key words】 exercise; rat; hippocampus; second messenger cAMP
在社会逐步走向老龄化的今天,与老龄化相伴的脑疾病日益增多,有关人类脑健康问题已成为一项世界性的研究课题。近年来,我国神经系统和精神疾病发病率呈逐年上升之势,这已引起了社会各界的广泛关注。体育运动作为一种强身健体的有效途径,它对中枢神经系统的影响及其与脑健康之间的关系已逐渐引起了人们的注意。合理的运动能够促进新陈代谢,增进活力,改善心血管功能,提高机体免疫力[1～4]。由于海马与学习记忆关系密切以及海马对衰老的易感,许多学者将海马作为脑衰老研究的理想模型。cAMP是最早确定的第二信使，作为细胞功能的信号传导物质参与学习记忆过程[5，6]。因此，研究海马与cAMP的表达变化将会对海马的学习记忆过程有重要意义。本研究旨在探讨6周持续游泳训练对大鼠海马cAMP表达的影响，初步探索运动促进脑康复的机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
实验动物：SD成年雄性大鼠30只，鼠龄3个月，体重250～300g，由山西医科大学动物实验中心提供。饲养条件：分笼饲养，每笼4只，自由饮食，自然昼夜节律光照，室温(20±5)℃。相对湿度在40%～60%。随机分为对照组(n=5)和持续组(n=25)。
1.2 运动模型建立
采用游泳运动方式建立运动动物模型。游泳条件：塑钢玻璃游泳池，150cm×60cm×70cm，水深为大鼠身体长度的2倍，约60cm，水温保持在33℃～36℃ 之间，每个游泳池随机分配5只大鼠。正式训练前运动组大鼠进行3天适应性游泳训练，3天的运动时间每天分别为15min、20min、30min。随后开始正式的游泳运动训练，每天游2次，每次150 min，中间休息120 min，共6周。训练结束后吹干毛发，返回鼠笼。
1.3 取材
最后一次游泳后，持续组大鼠按运动后即刻、30min、60min、120min、240min五个时段分别依次取材，操作如下：大鼠腹腔2%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，断头，冰上取脑，置于-80℃液氮冷藏。对照组操作同上。
从液氮取出大鼠脑组织，复温至常温。根据大鼠立体定向图谱, 分离脑组织切取大鼠海马组织约50～100mg，置于离心管，按10mg:200μl比例加入0.01M PBS液，用超声波细胞粉碎机将其制成乳白色悬液，12000r/min离心10min，取上清液放入-4℃冰箱保存备用。
1.4 cAMP含量的测定
cAMP浓度的测定均采用双抗体酶联免疫吸附法(Enzymes linked immunosorbant assays,ELISA法)，大鼠环磷腺苷cAMP ELISA试剂盒购自美国R·B公司,均严格按说明书进行操作。检测仪器采用Benchmark酶标仪(BIO-RAD公司)。
具体操作步骤：(1)加样：将100μl标准品、100μl标本加入相应反应板孔中;(2)轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育90min;(3)洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(4)每孔加入100μl 1×Biotin。轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育60min;(5)洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(6)每孔加入100μl 1×HRP。轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育30min;(7)洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(8)每孔加入50μl显色剂A和50μl显色液B, 轻轻混匀10s，37℃暗处温育(15±10)min;(9)每孔加入100μl 终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30s;30min内在450nm处读OD值。(10)以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。并根据样本的OD值查出其浓度。或用回归方程计算其浓度。
1.5 统计学方法
采用SPSS12.0软件对实验数据进行统计处理。所有数据均用平均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 大鼠海马在5个不同时刻cAMP浓度变化
见表1。根据统计学处理结果显示(表1)：运动后cAMP的浓度先下降后升高在30min达到峰值随后又下降。大鼠海马cAMP浓度在即刻、120min、240min有所下降,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);运动后60min大鼠海马cAMP浓度达到最低值(P<0.01);运动后30 min大鼠海马cAMP浓度达到峰值，与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。表1 大鼠海马在5个不同时刻cAMP浓度变化
2.2 大鼠海马cAMP在不同时刻表达的时效性
见图1。从图1来看，运动后，海马cAMP浓度随时间呈波浪式的变化，30 min组上升幅度较大，随后快速下降，120min、240min变化幅度逐渐趋于平缓。图1 大鼠海马cAMP在不同时刻表达的时效性
3 讨论
cAMP 是细胞内第二信使，参与学习和记忆过程。在生理状态下，神经细胞中cAMP 由三磷酸腺苷(ATP)经腺苷环化酶(AC)催化生成，由磷酸二酯酶(PDE)降解，二者的功能状态维持神经细胞cAMP 水平稳定。疾病、运动、药物等多种刺激因素均可引起神经细胞内cAMP浓度发生改变继而引发后续各种反应。cAMP对学习记忆在内的绝大多数生理功能的作用是通过激活PKA实现的。Byers 等的研究表明，细胞内cAMP 浓度的适当增加可激活PKA，而cAMP 的过量增加和减少都造成学习记忆能力下降。因此，cAMP可能在记忆巩固的后期阶段有着重要作用：一方面能够直接激活PKA(少数情况下能激活PKG);另一方面能够通过小分子量G结合蛋白或经环核苷酸门控的离子通道介导钙离子的流动，而发挥重要的信号传递功能。
运动作为典型的应激源，对cAMP浓度具有显著性影响，主要涉及血浆、肝脏、海马、心脏等方面。罗艳蕊等[7]研究表明8周游泳训练导致心脏代偿性肥大，cAMP/cGMP比值减小。黄元汛、张钧[8]研究发现，力竭运动使大鼠心肌中cAMP和cGMP均明显高于对照组，说明力竭运动可造成心肌中cAMP 和cGMP含量明显升高。Zimmer[9]在实验性压力超负荷动物模型的研究发现，压力超负荷与心肌cAMP和心肌肥厚显著正相关;压力超负荷诱导了心肌cAMP浓度上升，同时cGMP浓度下降，cAMP/cGMP比值增大，推测环核苷酸系统(cAMP/cGMP)可能介导了压力超负荷导致心肌肥大的反应。同时心肌组织cAMP含量于术后0.5h 明显增加，术后5天时达峰值，术后30天降至正常。李卫平等[10]实验表明：服用抗氧化剂对耐力运动组和间歇运动组恢复期的心肌cAMP浓度具有一定的影响，而对这两组恢复期的心肌cGMP浓度则并无显著性作用;运动方式和抗氧化剂是影响心肌cAMP、cGMP浓度变化的主要因素。徐松德等[11]将34只家兔随机分为对照、运动和不运动三组, 后两组每只家兔喂胆固醇200mg/d, 试验4周后。结果表明运动组动脉壁cAMP水平增加19.2%, 不运动组则降低49.4%;肝脏cAMP含量运动组与不运动组分别降低21.2%和15.7%, 血浆cAMP浓度运动组与不运动组分别升高0.95%和6.8%。王泽军等[12]研究表明游泳训练可以使大鼠海马cAMP浓度分别发生了显著的升高。Bernabeu[13]在实验中发现大鼠海马cGMP水平在训练后即刻达峰值，相反cAMP水平在3h后才达峰值，说明运动对cAMP浓度的影响具有时效性。
本文把持续有氧运动作为应激源对大鼠进行实验研究，有氧训练具有强度低、有节奏、持续时间较长的特点。研究显示：与对照组相比，运动组大鼠海马cAMP的浓度发生了显著的变化。运动后cAMP的浓度先下降后升高，在30min达到峰值随后又下降。大鼠海马cAMP浓度在即刻、120min、240min有所下降，与对照组相比差异有显著性(P<0.05);运动后60min大鼠海马cAMP浓度达到最低值(P<0.01);运动后30 min大鼠海马cAMP浓度达到峰值，与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。 原因可能是：cAMP主要是神经递质和激素的后续产物，可能与运动时交感神经兴奋释放去甲肾上腺素有关，其含量随神经递质和激素变化而变化，cAMP 水平维持可能更多地依赖于神经递质和激素的释放，所以cAMP 水平在运动时一过性升高。而持续有氧运动进行的则属系统训练;这可能是因为适宜的有氧运动由于其运动强度低，持续时间较短。因此对机体的影响作用是一个长期的效应，而学习记忆是大脑的高级功能，涉及脑部多个功能核团及脑区及其递质调质系统的功能活动，适宜而有益的刺激很难在短时间显示其影响效应的缘故。海马cAMP浓度的变化，可能与运动方式以及脑区位置等因素有关。本实验可对脑疾病提供一定的参考价值，对脑健康有重要意义。但其具体的机制还不清楚，有待进一步研究。
【参考文献】
1 Anderson BJ, Rapp DN, Baek DH,et al. Exercise influences spatial learning in the radial arm maze. Physiology and Behaviar,2000,70 (5):425-429.
2 Laurin D, Verreault R, Lindsay J, et al. Physical activity and risk of cognitive impairment and dementia in elderly persons. Archives of Neurology,2001,58(3):498-504.
3 Raffaella Molteni, Zhe Ying and Fernando Gomez - Pinilla. Differential effects of acute and chronic exercise on plasticity - related genes in the rat hippocampus revealed by microarray. European Journal of Neuroscience, 2002,16:1107-1116.
4 J. L. Trejo, E. Carro, I. TORRES - Aleman, Circulating insulin -likegrown factor I mediates exercise - induced increases in the number of new neurons in the adult hippocampus. J Neurosci, 2001, 22 : 1628 -1634.
5 Nazif FA,Byren J H, Cleary LJ . cAMP induces long -term morphological changes in sensory neurons of Aplysia.Brain Research,1991,539∶324-327.
6 Vianna MR, Izquierdo LA,Barros DM,et al. Differentialrole of hippocampal cAMP - dependent protein kinase inshort and long - term memory.Neurochemistry Research,2000,25 (5) :621-626.
7 罗艳蕊,漆正堂.游泳训练后大鼠心肌细胞cAMP、cGMP含量的变化.中国应用生理学杂志,2005,21(2):185-186.
8 黄元汛,张钧.牛磺酸对大鼠力竭运动时第二信使及心肌线粒体中钙离子含量变化的影响.中国运动医学杂志,1999,18(2):130-133.
9 Zimmer H G, Petter H. Metabolic aspects of the development of experimental cardiac hypertrophy.Basic Res Cardiol, 1986,81:127-137.
10 李卫平,陈峰,吴正平. 不同运动方式和抗氧化剂对大鼠心肌cAMP 、cGMP 代谢的影响.武汉体育学院学报,2008,42(5):85-87.
11 徐松德,吴湘云.运动对喂胆固醇家兔血浆动脉壁及肝脏水平的影响.山东医学院学报,1985,23(2):40-43.
12 王泽军.游泳训练对大鼠空间学习记忆力和脑内NO/·OH-cGMP、cAMP的影响.上海:华东师范大学,2006.
13 Bernabeu R,Bevilaqua L,Ardenghi P,et al.Involvement of hippocampal cAMP/Camp-dependent protein kinase signaling pathways in a late memory consolidation phase of aversively motivated Learning in rat.Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 94:7041-7046.