6周间歇负重游泳运动对大鼠海马cAMP浓度影响的实验研究*

【摘要】  目的观察6周间歇负重游泳运动对大鼠海马cAMP表达的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分为对照组(n=5只)和间歇运动组(n=25只)。建立大鼠间歇游泳运动模型，采用elisa 法检测训练后即刻、30min、60min、120min、240min大鼠海马cAMP表达的变化,并用统计学软件进行数据分析。结果运动后海马cAMP浓度随时间呈波浪式的变化，而且幅度也逐渐增大。与对照组对比，运动后即刻、60min cAMP浓度有所上升,差异无显著性(P>0.05);运动后240min cAMP浓度达到峰值，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);而运动后30min、120min cAMP浓度呈下降趋势，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。结论6周间歇负重游泳运动对大鼠海马cAMP的表达有一定的影响，并具时效性。

【关键词】  间歇运动;大鼠;海马;第二信使cAMP

　　【Abstract】ObjectiveTo observe the intermittent weight-bearing for six weeks of swimming exercise on hippocampal expression of cAMP.Methods30 male SD rats were randomly divided into control group (n=5) and intermittent exercise group (n=25rats). Established a rat model of intermittent swimming, elisa assay was used immediately after training, 30min, 60min, 120min, 240min for hippocampal cAMP changes in expression, and statistical data were analyzed.ResultsAfter exercise in hippocampal cAMP concentration showed wave type changes, but the range is gradually increasing. Compared with the control group, immediately after exercise, 60min cAMP concentration has increased, there was no significant difference (P>0.05); at 240min cAMP concentration was at the peak, compared with the control group with significant difference (P<0.01) ; and after exercise 30min, 120min cAMP concentration is declining, compared with the control group there were significantly different (P<0.01). ConclusionThe six-week swimming intermittent weight-bearing exercise on the expression of cAMP in rat hippocampus have a certain impact, with timeliness.

　　【Key words】Intermittent exercise; rat; hippocampus; second messenger cAMP

　　运动能促进人的认知功能和个性发展, 特别是学习记忆这种脑功能的高级形式[1]。大量动物实验也表明,运动有助于动物海马等与学习记忆密切相关脑区神经元的增殖、存活和分化, 促进长时程增强的诱导,提高实验动物的空间记忆和被动逃避记忆能力[2，3]。cAMP是最早确定的第二信使，作为细胞功能的信号传导物质参与学习记忆过程[4，5]。因此，研究海马与cAMP的表达变化将会对海马的学习记忆过程有重要意义。本研究是在前期持续游泳运动对海马cAMP表达影响及不同方式游泳运动对大鼠纹状体cAMP浓度影响的实验研究[6，7]的基础上，进行了6周间歇负重游泳运动对大鼠海马cAMP表达时效性的研究，初步全面探索了运动促进学习记忆的分子机制。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物和分组实验动物：SD成年雄性大鼠30只，鼠龄3个月，体重250～300g，由山西医科大学动物实验中心提供。饲养条件：分笼饲养，每笼4只，自由饮食，自然昼夜节律光照，室温(20±5)℃。相对湿度在40%至60%。随机分为对照组(n=5只)和间歇组(n=25只)。

　　1.2运动模型建立采用游泳运动方式建立运动动物模型。游泳条件：塑钢玻璃游泳池，150cm×60cm×70cm，水深为大鼠身体长度的2倍，约60cm，水温保持在33℃ 至36℃ 之间，每个游泳池随机分配5只大鼠。正式训练前运动组大鼠进行3天适应性游泳训练，3天的运动时间每天分别为15min、20min、30min。随后开始正式的游泳运动训练，每周训练6 次,共训练6 周。负重为体重5 % ,游泳6 min ,休息4 min ,每天连续进行10 组。对照组不做任何运动,常规饲养,自由活动。训练结束后吹干毛发，返回鼠笼。

　　1.3取材最后一次游泳后，间歇组大鼠按运动后即刻、0.5h、1h、2h、4h五个时段分别依次取材，操作如下：大鼠腹腔2%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，断头，冰上取脑，置于-80℃液氮冷藏。对照组操作同上。从液氮取出大鼠脑组织，复温至常温。根据大鼠立体定向图谱, 分离脑组织切取大鼠海马组织约50～100mg，置于离心管，按10mg：200μl比例加入0.01M PBS液，用超声波细胞粉碎机将其制成乳白色悬液，12000r/min离心10min，取上清液放入-4℃冰箱保存备用。

　　1.4cAMP含量的测定cAMP浓度的测定均采用双抗体酶联免疫吸附法(Enzymes linked immunosorbant assays,ELISA法)，大鼠环磷腺苷cAMP ELISA试剂盒购自美国R·B公司,均严格按说明书进行操作。检测仪器采用Benchmark酶标仪(BIO-RAD公司)。具体操作步骤：(1)加样：将100μl标准品、100μl标本加入相应反应板孔中;(2)轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育90min;(3)洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(4) 每孔加入100μl 1×Biotin。轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育60min;(5)洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(6)每孔加入100μl 1×HRP。轻轻混匀30s，封住板孔，37℃温育30min;(7)洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(8)每孔加入50μl显色剂A和50μl显色液B, 轻轻混匀10s，37℃暗处温育(15±10)min;(9)每孔加入100μl终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30s;30min内在450nm处读OD值。(10)以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。并根据样本的OD值查出其浓度。或用回归方程计算其浓度。

　　1.5统计学方法采用SPSS12.0软件对实验数据进行统计处理。所有数据用均数±标准(x±s)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2实验结果

　　根据统计学处理结果显示(表1)：运动后即刻、60min组cAMP浓度有所上升, 与对照组相比差异无显著性(P>0.05);运动后240min cAMP浓度达到峰值，与对照组相比差异有非常显著性(P<0. 01);而运动后30min、120min cAMP浓度呈下降趋势，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。从图1来看，运动后，海马cAMP浓度随时间呈波浪式的变化，即刻、60min组变化幅度较小，随后变化幅度逐渐增大，240min cAMP浓度突然升高，达到峰值。 图1大鼠海马cAMP在不同时刻表达的时效性表1大鼠海马在五个不同时刻cAMP 浓度变化

　　3讨论

　　3.1海马cAMP表达的意义海马结构位于大脑半球颞叶内侧深部,是参与学习记忆功能的最重要脑区之一，是长期记忆的暂时贮存场所，对新习得的信息进行为期数周到数月的加工，然后将这种信息传输到大脑皮层的有关部位作更长时间的贮存,贮存在大脑皮层不同部位的记忆信息再由额叶皮层的记忆活动表现出来。cAMP是最早确定的细胞内的第二信使，是细胞膜的腺苷酸环化酶(AC)作用ATP后的产物。以微量存在于动植物细胞和微生物中，但在激素或应激作用下可升高到一百倍以上。cAMP是细胞功能的信号传导物质,参与细胞代谢、激素合成和分泌等活动。同时参与学习记忆过程[4，5]。cAMP对学习记忆在内的绝大多数生理功能的作用是通过激活PKA实现的。在促进短时程记忆形成期间，PKA通过共价修饰突触前末梢各种蛋白的结构并提高其活性，从而促进经典递质的释放;而在长时程记忆形成期间，PKA的C亚基可位移到细胞核内，使CREB等多种蛋白质发生磷酸化，从而可增强多种靶基因的表达，形成新的突触联系，使获得的信息能够长期储存。

　　3.2间歇运动训练对cAMP表达的影响大量研究证明，运动对cAMP浓度影响具有显著性。罗艳蕊等[8]研究表明8周游泳训练导致心脏代偿性肥大，cAMP/cGMP比值减小。黄元汛、张钧[9]研究发现,力竭运动使大鼠心肌中cAMP和cGMP均明显高于对照组,说明力竭运动可造成心肌中cAMP 和cGMP含量明显升高。Zimm[10]在实验性压力超负荷动物模型的研究发现，压力超负荷与心肌cAMP和心肌肥厚显著正相关;压力超负荷诱导了心肌cAMP浓度上升，同时cGMP浓度下降，cAMP/cGMP比值增大，推测环核苷酸系统(cAMP/cGMP)可能介导了压力超负荷导致心肌肥大的反应。同时心肌组织cAMP含量于术后0.5h明显增加，术后5天时达峰值，术后30天降至正常。李卫平,陈峰,吴正平[11]实验表明：服用抗氧化剂对耐力运动组和间歇运动组恢复期的心肌cAMP浓度具有一定的影响，而对这两组恢复期的心肌cGMP浓度则并无显著性作用;运动方式和抗氧化剂是影响心肌cAMP、cGMP浓度变化的主要因素。徐松德等[12]将34只家兔随机分为对照、运动和不运动三组, 后两组每只家兔喂胆固醇200mg/d, 试验4周后。结果表明运动组动脉壁cAMP水平增加19.2%,不运动组则降低49.4%;肝脏cAMP含量运动组与不运动组分别降低21.2%和15.7%, 血浆cAMP浓度运动组与不运动组分别升高0.95%和6.8%。王泽军等[13]研究表明游泳训练可以使大鼠海马cAMP浓度分别发生了显著的升高。Bernabeu[14]在实验中发现大鼠海马cGMP水平在训练后即刻达峰值，相反cAMP水平在3h后才达峰值 ,说明间歇运动对cAMP浓度的影响具有时效性。本文把间歇运动作为应激源对大鼠进行实验研究，间歇训练法是一种极限强度并且严格控制运动和间歇时间的无氧训练方法，由于间歇期的存在，几乎在整个运动期均为最高强度的运动，并且能重复多次，因而在强度和量方面均保持高水平，在供能及生理反应特点上均严格区分于持续训练、静力训练甚至大强度衰竭性训练[15]。实验结果表明：运动结束后，海马cAMP浓度随时间呈波浪式的变化，而且幅度也逐渐增大。与对照组对比，运动后即刻、60min组cAMP浓度有所上升，差异无显著性(P>0.05);运动后240min cAMP浓度达到峰值，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);而运动后30min、120min cAMP浓度呈下降趋势，与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01)。说明间歇运动可以促进大鼠海马cAMP的表达，激活海马的神经元，促进神经元的活化，加强大鼠的学习记忆功能。运动刺激后cAMP 的表达呈波浪式的变化，峰值出现的时间和持续的时间可能与训练方式有关。原因可能是由于长期的运动训练刺激，使cAMP-PKA通路中的某些激素受体的反应能力不断地增强所致。cAMP 对细胞周期的控制作用的大量研究结果表明，凡能使细胞内cAMP 含量下降的因素均能促进DNA 的合成和细胞的分裂增殖，凡能使细胞内cAMP 含量升高的因素均能促进细胞分化[16]。通过cAMP的变化又是如何影响PKA、CREB等相关蛋白激酶和转录因子的，这些问题的提出与解决，或许会有助于我们今后更深入的研究。

【参考文献】
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　　2Radak Z,Kaneko T,Tahara S, et al. Regular exercise improves cognitive function and decreases oxidative damage in rat brain.Neurochemistry Int,2001,38(1):17-23.

　　3Adlard PA,Perreau VM,Cesar CE, et al. The Time - course of induction of brain - derived neurotrophic factor mRNA and protein in the rat hippocampus following voluntary exercise.Neuroscience Letters,2004,363(1):43-48.

　　4Nazif FA,Byren JH,Cleary LJ.cAMP induces long -term morphological changes in sensory neurons of Aplysia.Brain Research,1991,539：324-327.

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　　7张安民，张青元，于芳，等.不同方式游泳运动对大鼠纹状体cAMP浓度影响的实验研究.体育科学，2010，30(1)：62-65.

　　8罗艳蕊,漆正堂.游泳训练后大鼠心肌细胞cAMP、cGMP含量的变化.中国应用生理学杂志,2005,21(2):185-186.

　　9黄元汛,张钧.牛磺酸对大鼠力竭运动时第二信使及心肌线粒体中钙离子含量变化的影响.中国运动医学杂志,1999,18(2):130-133.

　　10Zimmer HG, Petter H. Metabolic aspects of the development of experimental cardiac hypertrophy.Basic Res Cardiol,1986,81:127-137.

　　11李卫平,陈峰,吴正平.不同运动方式和抗氧化剂对大鼠心肌cAMP、cGMP代谢的影响.武汉体育学院学报,2008,42(5):85-87.

　　12徐松德,吴湘云.运动对喂胆固醇家兔血浆动脉壁及肝脏水平的影响.山东医学院学报,1985,23(2):40-43.

　　13王泽军.游泳训练对大鼠空间学习记忆力和脑内NO/oOH-cGMP、cAMP的影响.上海:华东师范大学,2007.

　　14Bernabeu R,Bevilaqua L,Ardenghi P,et al.Involvement of hippocampal cAMP/Camp-dependent protein kinase signaling pathways in a late memory consolidation phase of aversively motivated Learning in rat.Proc Natl Acad Sci USA,1998,94:7041-7046.

　　15洪长青,邓树勋.三种训练对大鼠心肌细胞超微结构的影响.浙江体育科学,2000,22(3):55-58.

　　16李光伟,潘孝仁.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数.中华内科杂志,1993,32(10):656-660.