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首页医源资料库在线期刊中华医学研究杂志2012年第12卷第8期

游泳耐力训练对大鼠杏仁核cAMP值影响的实验研究*

来源:中华医学研究杂志
摘要:【摘要】目的观察游泳耐力训练后大鼠杏仁核cAMP浓度变化。方法将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、耐力训练组。建立大鼠游泳耐力训练模型,用大鼠环磷酸腺苷cAMPELISA法,检测训练后即刻、0。5h、1h、2h、4h大鼠杏仁核cAMP浓度变化,并用统计学软件进行数据分析。...

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【摘要】  目的观察游泳耐力训练后大鼠杏仁核cAMP浓度变化。方法将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、耐力训练组。建立大鼠游泳耐力训练模型,用大鼠环磷酸腺苷cAMP ELISA法,检测训练后即刻、0.5h、1h、2h、4h大鼠杏仁核cAMP浓度变化,并用统计学软件进行数据分析。结果(1)耐力训练后,除1h时cAMP浓度显著低于对照组外(P<0.01),即刻、0.5h、2h大鼠杏仁核cAMP浓度均显著高于对照组,且差异有显著性(P<0.05);(2)训练后即刻,大鼠杏仁核cAMP浓度快速升高,至0.5h时达到最高值,之后1h时cAMP浓度急剧下降,2h时其浓度回升,高于对照组水平,随后下降至4h时略低于对照组水平,但不存在差异。整个浓度变化曲线呈锯齿形。结论游泳耐力训练后杏仁核cAMP浓度变化具有时相性;耐力游泳训练可激活大鼠杏仁核环磷酸腺苷(cAMP)通路,进而影响机体的后续反应。

【关键词】  杏仁核;cAMP;游泳耐力训练

  【Abstract】ObjectiveThe purpose of this study is to analyze the effect of endurance exercise on the density of cAMP in the amygdale.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into two groups,control group (five rats) and endurance exercise group (25 rats).To establish the endurance swimming exercise models in rat,and detect the change of the cAMP contents in amygdale at the moments of 0h,0.5h,1h,2h,4h after exercise by using the method of ELISA,then analyze the data by statistical software.ResultsThe result showed that :(1)After exercise,the cAMP contents in amygdale of rats at 0h,0.5h,2h after endurance swimming has higher level than control group(P<0.05),besides the cAMP contents of the intermittent group at 1h is lower than the control group (P<0.01);(2)In amygdale,the cAMP contents rising rapidly and reach the peak at 0.5h after swimming finished,then the cAMP contents dropped at 1h,the cAMP contents increased at 2h,the level was higher than that of control group,and then dropped,the level was still lower than that of control group at 4h after swimming finished.The change figure of cAMP contents appears the shape of sawteeth.ConclusionThere must be a phasic change in the contents of cAMP.Endurance swimming could influence the cAMP signaling pathway in amygdale of ratswith effecting the body's response.

  【Key words】amygdale; cAMP; endurance exercise

  杏仁核位于大脑颞叶背内侧部,居海马旁回钩的深面,侧脑室下角尖端,是大脑基底神经核的一个重要核团,与感觉、情绪和记忆关系密切。在整合和控制情绪,调节自主行为方面具有重要作用。杏仁核参与获取和储存有关记忆的活动,通过此记忆,动物可以识别和分析一个刺激的生物意义,然后将产生的信息传到脑干执行系统。环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate ,cAMP) 是中枢神经系统中重要的第二信使,可介导多种细胞内激素,神经递质及其他信号分子,在细胞代谢及多种生理效应的实现中具有关键的作用[1,2]。依据课题前期研究及有关专家研究表明:多种应激均可引起脑神经cAMP表达增强并诱导机体后续反应[3~11]。因此,观察游泳耐力训练对大鼠杏仁核cAMP浓度的影响,对于了解运动应激引起的机体反应过程及其机制具有重要的意义。同时,也为运动在维持脑健康功能与合理调配运动处方提供更多的实验数据和参考。

  1材料与方法

  1.1实验动物与分组实验动物:SD成年雄性大鼠30只,鼠龄3个月,体重250~300g,由山西医科大学动物实验中心提供。饲养条件:分笼饲养,每笼4只,自由饮食,自然昼夜节律光照,室温(20±5)℃。相对湿度在40%~60%。随机分为对照组(n=5只)和持续组(n=25只)。

  1.2实验所需仪器标准化学实验台和常规仪器设备,低温冰柜,高速离心机,液氮冷藏桶,恒温干燥箱,JY92-2D超声波细胞粉碎机,Benchmark酶标仪,10~200μl和可调多通道(8)移液器(50~200μl)lL洗瓶,1L圆形量筒,移液器枪头,纸巾,计时器,处理器和消毒剂,试剂存放槽。所需试剂:大鼠环磷腺苷cAMP ELISA试剂,去离子水(双蒸水),0.01%PBS液,2%戊巴比妥钠。

  1.3训练造模采用游泳训练方式。游泳条件:塑钢游泳池,150cm×60cm×70cm,水深为大鼠身体长度的2倍,水温保持在33℃~36℃之间。正式训练前,大鼠进行3天适应性游泳训练,每天1次,时间依次分别15min、20min、30min。随后开始正式游泳训练6周。每天游2次,每次150min,中间休息120min。对照组:不进行任何训练,常规饲养。

  1.4取材最后一次游泳后,游泳组大鼠按训练后即刻、0.5h、1h、2h、4h五个时段分别依次取材,操作如下:大鼠腹腔2%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg),断头,冰上取脑,置于-80℃液氮冷藏。对照组操作同上。从液氮取出大鼠脑组织,复温至常温。根据大鼠立体定向图谱,分离脑组织切取大鼠杏仁核组织约50~100mg,置于离心管,按10mg:200μl比例加入0.01M PBS液,用超声波细胞粉碎机将其制成乳白色悬液,12000r/min离心10min,取上清液放入-4℃冰箱保存备用。

  1.5测定方法cAMP浓度的测定均采用双抗体酶联免疫吸附法(Enzymes linked immuno sorbant assays,ELISA法),大鼠环磷腺苷cAMP ELISA试剂盒购自美国R·B公司,均严格按说明书进行操作。检测仪器采用Benchmark酶标仪(BIO-RAD公司)。具体操作步骤:(1)加样:将100μl标准品、100μl标本加入相应反应板孔中;(2)轻轻混匀30s,封住板孔,37℃温育90min;(3)洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(4)每孔加入100μl 1×Biotin。轻轻混匀30s,封住板孔,37℃温育60min;(5)洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(6)每孔加入100μl 1×HRP。轻轻混匀30s,封住板孔,37℃温育30min;(7)洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350μl洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次;(8)每孔加入50μl显色剂A和50μl显色液B,轻轻混匀10s,37℃暗处温育(15±10)min;(9)每孔加入100μl终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30s;30min内在450nm处读OD值。(10)以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。并根据样本的OD值查出其浓度。或用回归方程计算其浓度。

  1.6统计学方法采用SPSS12.0软件对实验数据进行统计处理。所有数据均用平均数±s标准差表示,组间比较采用方差分析,检验水准α=0.05。

  2实验结果

  2.1游泳耐力训练后对大鼠体重的影响结果显示,游泳耐力训练后对大鼠体重影响较大。在训练前对照组大鼠体重与持续组相比差异无显著性(P>0.05),大鼠游泳运动1周后,体重开始发生变化,对照组大鼠体重随时间而逐渐增加,游泳组大鼠体重在第3周下降较为明显,随后保持稳定;游泳组大鼠体重在各时间点均低于对照组,且差异有非常显著性(P<0.001)。

  2.2游泳耐力训练后对大鼠杏仁核cAMP表达的影响实验结果显示(见表1):对照组大鼠杏仁核cAMP浓度值为(4.64±0.47)pmol/g,游泳耐力训练后,大鼠杏仁核cAMP浓度均明显增加,即刻组大鼠杏仁核cAMP浓度值达到(5.16±0.49)pmol/g,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);随后,大鼠杏仁核cAMP浓度值快速升高,至0.5h达到峰值,与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);之后1h大鼠杏仁核cAMP浓度值急剧下降,与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);2h时cAMP浓度上升到(5.15±0.15)pmol/g,显著高于对照组的水平(P<0.05);4h后,大鼠杏仁核cAMP浓度值降为(4.4±0.2)pmol/g,略低于对照组水平,但差异无显著性(P>0.05)。从时效性来看(见图1),游泳耐力训练后即刻,大鼠杏仁核cAMP浓度即开始增高,至0.5h时达到最高值,随后cAMP浓度值逐渐下降,至4h时仍高于对照组水平。整个大鼠杏仁核cAMP浓度变化曲线呈锯齿形特征。表1游泳耐力训练后大鼠杏仁核cAMP浓度值  图1游泳耐力训练后大鼠杏仁核cAMP浓度变化图

  3讨论

  cAMP是细胞内重要的“第二信使”生物活性物质,参与细胞的分化、增殖、代谢及免疫反应并起重要的调节作用。目前认为:作为细胞内信使,cAMP浓度的变化相当快,在细胞对激素的反应中,几秒钟内cAMP的浓度变化达5倍以上,这种快速反应的机制是通过两种酶实现的,腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶(cAMP)。当细胞受到外界刺激时,胞外信号分子首先与受体结合形成复合体,然后激活细胞膜上的Gs-蛋白,被激活的Gs-蛋白再激活细胞膜上的腺着酸环化酶(AC),催化ATh脱去一个焦磷酸而生成cAMP。生成的 cAMP作为第H信使通过激活APK(cAM依赖性蛋白激酶),使靶细胞蛋白磷酸化,从而调节细胞反应,cAMP最终又被磷酸二酯酶(PDE)水解成5′-AMP而失活。cAMP生成和分解过程依赖 Mg2+的存在。AC和PDE可以从两个不同方面调节细胞内cAMP浓度,从而影响细胞、组织、器官的功能。研究表明:疾病、药物等多种刺激因素均可引起神经细胞内cAMP浓度发生改变继而引发后续各种反应[4~11]。

  运动作为一种特殊典型的应激源,对cAMP浓度变化有着显著的影响[12,13]。王泽军[12]比较与分析了长期的游泳训练对大鼠空间学习记忆能力的影响及其与NO/·OH-cGMP与cAMP信号传导之间的关系,结果表明训练组大鼠海马、前额叶皮质中cAMP浓度显著高于对照组,存在极显著性升高(P<0.01),证实运动可通过cAMP的作用对记忆的后期巩固阶段产生重要的作用。徐波的研究显示,游泳训练可引起脑内突触前膜多巴胺、5-HT等神经递质浓度增加,这些递质作为细胞间传递信息的第一信使,作用于突触后膜的相关受体上,引起cAMP的产生[13]。杏仁核是边缘系统中重要的皮质下核团,其结构复杂,纤维联系和功能十分广泛,主要包括三个主要核群,杏仁中央核(CeA)、基底外侧核群(BLA)、皮质内侧核群(MeA),是参与情绪性学习认知的重要结构,是学习和记忆相关的重要脑区。杏仁中央核、基底核是各种感觉体会集的中心,它们在获取和储存有关记忆中发挥了重要作用。新近的研究表明,杏仁核对于理解他人内心状态和意愿的社会性认知过程极其重要[14,15]。本文把持续有氧运动作为应激源对大鼠杏仁核进行实验研究,研究显示,训练后即刻,大鼠杏仁核内cAMP浓度明显增加,至0.5h达到峰值,与对照组相比差异有非常显著性(P<0.01);之后1h大鼠杏仁核cAMP浓度值急剧下降,达到最低值(P<0.01);随后回升2h时cAMP浓度上升到(5.15±0.15)pmol/g,显著高于对照组的水平(P<0.05);4h后,大鼠杏仁核cAMP浓度值下降,与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。实验结果提示:游泳耐力运动对大鼠脑杏仁核cAMP浓度的影响具有显著性和时效性。训练即刻、0.5h杏仁核内cAMP浓度明显增加,表明训练刺激引起杏仁核神经细胞兴奋,突触前神经末梢释放递质作用于突触后膜上相应的受体并激活AC,在突触后膜合成cAMP,进而激活PKA,通过膜蛋白的磷酸化改变膜对离子的通透性,从而影响杏仁核神经细胞后续生理生化反应;持续游泳训练后大鼠杏仁核cAMP浓度变化存在一定时效性,整个cAMP浓度变化曲线呈锯齿形,提示训练后杏仁核内神经元细胞发生复杂的生理生化反应,其转导通路中可能存在具有促进作用的正反馈环和抑制作用的负反馈环,对信号转导过程进行调节。因此,游泳耐力训练后大鼠杏仁核cAMP浓度时程变化必然是多种神经细胞信号整合的结果[16],绝非仅受单因素影响,其机理有待进一步研究探明。脑内神经细胞cAMP浓度变化可引起多种反应,不仅可改变细胞膜通透性,调制神经递质释放,还是一个重要的基因表达调控物质[17,18]。近年来的研究表明,cAMP可以调节和活化许多转录因子,包括cAMP反应元件结合蛋白 (CREB) 、 cAMP 反应元件调节子(CREM)、 NF-KB、 核受体等,其中大多涉及细胞的新陈代谢、增殖、分化、凋亡[16]。Montndny等[17]发现许多cAMP诱导转录的真核基因的启动子(与RNA聚合酶结合的DNA序列,决定了精确的转录起始和转录频率)周围多含有一致或近乎一致的8个碱基对的回文序列5'-TGACGTCA-3′,并命名为cAMP反应序列(CRE),是这些基因识别cAMP信号的重要部位。本课题前期研究结果显示[19]:持续游泳运动可引起大鼠杏仁核c-fos基因表达,而c-fos基因就含有cAMP反应序列CRE,表明持续游泳运动引起的cAMP浓度变化可能与c-fos基因表达紧密相关。也有研究显示:胞内Ca2+浓度变化可通过Ca2+/CaM-PK I和II导致CREB磷酸化而激活CREB,其激活位点与PKA激活CREB位点相同。提示运动后c-fos基因表达并非受单个信号系统调控,cAMP 和Ca2+在信号传递上存在某种耦合现象。钙调蛋白可能在其中起到重要调控作用[20]。游泳耐力训练能够引起杏仁核内cAMP浓度升高并产生后续时程变化,显示运动刺激能够对脑内神经中枢信号传导产生明显作用,反映游泳耐力训练对脑康复和健脑益智具有一定意义。其运动后cAMP浓度时程变化特征可为制订相应运动处方提供参考。今后应对运动因素(运动强度,运动时间,运动间歇,运动频率等)与不同脑区cAMP浓度时程变化特征(表达峰值,表达持续时间,表达速度快慢等)之间关系以及内在机制进行深入研究,以为优化运动处方提供依据。

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作者: 张安民,李英,燕虹,胡淑萍作者单位:030006 山西太 2013-2-26
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