间充质干细胞体内成骨的实验研究

　　摘  要：［目的］探讨间充质干细胞在体内的成骨能力。［方法］从羊髂嵴处抽取10~15 ml骨髓组织，用Percoll分离液按梯度离心法分离出间充质干细胞，培养、增殖后种植在多孔β磷酸三钙上，构建组织工程化骨，植入8只羊的左后肢跖骨缺损区（长21 mm）作为实验组；单纯植入多孔β磷酸三钙陶瓷材料的8只羊作为对照组；分别在术后6、12、24周处死动物行放射学、组织学和生物力学检测。［结果］放射学和组织学检测，术后6周实验组即可见有新骨生成，对照组则无明显新骨生成；骨缺损部位新生骨样组织、编织骨和板状骨出现的时间实验组也都较对照组早，并且不经软骨介导即能直接成骨，而对照组从两端以“爬行替代”方式成骨。术后24周，放射学和生物力学检测显示实验组骨缺损几乎完全修复，对照组只有部分愈合。［结论］间充质干细胞不仅在体外具有良好的增殖能力，回植入体内后仍然具有良好的成骨能力，不需经过软骨过程就能直接形成新骨，显示了间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞良好的应用前景。

    关键词：组织工程化骨；  骨缺损；  新生骨；  间充质干细胞

      Study of the osteogenic ability of mesenchymal stem cells in vivo∥LI Zhanghua，PENG Hao,LIAO Wen，et alDepartment of Orthopaedics,Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan 430060

    Abstract：［Objective］To investigate the osteogenic ability in vivo of mesenchymal stem cells（MSCs）［Method］Tenfifteen ml bone marrow aspirates were harvested from the iliac crest of sheep and enriched for MSCs by density gradient centrifugation over a Percoll cushion（1073 g/ml）After cultured and proliferated,the tissueengineered bones were constructed with these cells and seeded onto porous 13tricalcium phosphate ceramics（13TCP）Then,the constructs were implanted into left metatarsus defect（21 mm in length）of 8 sheep as an experimental groupPorous βTCP composed with bone marrow was implanted into defects of same size and position in 8 sheep as a control groupSheep were sacrificed in the 6th,12th,and 24th week postoperatively,and the implanted samples were examined by radiograph,histology,and biomechanical analysis［Result］New bone tissue was observed either radiographically or histologically at the defect area of experimental group as early as the 6th week postoperatively;but was not observed in the control groupBecause of the new bone formed in a direct manner without progression through a cartilaginous process intermediately,osteoid tissue,woven bone and lamellar bone,occurred earlier in the experimental group than in the control group,in which the bone defects were repaired in a “creep substitution” mannerAt the 24th week,radiographs and biomechanical tests revealed an almost complete repair of the defect in experimental group,but only a partial repair in the control group［Conclusion］MSCs have good reproductive activity not only in vitro,but also in vivoThe new bone formed in a direct manner without progression through a cartilaginous process intermediately when MSCs were transplanted in vivoThe results demonstrated that MSCs was an excellent seed cells for bone tissue engineering

    Key words：Tissueengineered bone;  Bone defect;  Regenerated new bone;  Mesenchymal stem cells

    迄今为止，大节段的骨缺损修复仍然是骨科医生面临的巨大挑战。现有的自、异体骨移植法都有一定的局限性，因此有必要寻找一种新的修复骨缺损的方法。多孔β磷酸三钙陶瓷具有良好的生物降解性、生物相容性，而且无毒性，结构稳定并适合细胞生长，因而是骨组织工程理想的支架材料〔1〕。然而，为了增加材料的生物活性还需要增加一些刺激骨生长的物质，包括骨髓、干细胞、成骨细胞、骨形态蛋白等。骨髓细胞中包括有造血干细胞和具有成骨潜能的间充质干细胞，这种干细胞具有多向分化潜能，故而能分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪和造血基质等多种组织。本研究的目的就是探讨间充质干细胞在体内的成骨能力。

    1  材料与方法

    11  材  料

    111  实验用品

    LDMEM（Gibco，BRL，USA），胎牛血清（FCS，Gibco，BRL，USA），其它化学用品均购自Sigma公司。多孔β磷酸三钙陶瓷由法国地中海大学卢建熙博士提供，呈圆柱状，长21 mm，直径10 mm，孔隙率70％，孔径（450±50）μm，连接径（150±50）μm，γ射线消毒，剂量25KGY。

    112  动  物

    成年绵羊16只，年龄（2±05）岁，体重（35±10）kg。术前予以标准的动物饲料和流动水。将动物随机均分成两组：第1组，β磷酸三钙陶瓷植入组;第2组，β磷酸三钙陶瓷与自体间充质干细胞复合植入组。

    12  方  法

    121  分离、培养间充质干细胞

    在全麻、无菌条件下，用18号穿刺针从羊髂嵴处抽取10～15 ml新鲜骨髓，肝素抗凝（200 U／mL）。为了防止穿刺时骨髓被血液稀释，应分别在髂嵴上不同的3个点进行穿刺。按照前述的方法分离、培养间充质干细胞〔2〕。首先把骨髓与含10％ FCS的LDMEM培养基混合，培养基中含青、链霉素（100 U／mL），细胞计数后用Percoll分离液（1073 g／mL）梯度分离间充质干细胞。收集界面层细胞，洗涤后种植在75 cm×75 cm的培养瓶中，每瓶含细胞1×106个。然后将它培养在37 ℃，5％ CO2和100％湿度的孵箱中。第3 d换液，去除不贴壁的细胞，以后每周更换培养液2次。在第9、10或11 d时以8×103个／mL的密度传代，直至培养的第16 d。

    122  构建多孔β磷酸三钙陶瓷与细胞复合体

    在培养的第16 d用胰酶和乙二胺四乙酸消化细胞，收集、重悬，调整细胞浓度至1×108个／mL（骨形成所需的标准起始细胞浓度），将细胞悬液均匀地滴加在β磷酸三钙陶瓷材料上即成为陶瓷-细胞复合体。复合体先在37 ℃、5％ CO2和100％湿度的孵箱中干孵育6 h，然后再加入含15％ FCS的LDMEM培养基继续孵育24 h。

    123  手术过程

    手术在全麻、无菌条件下进行，手术过程与文献报道相同〔3〕。术区脱毛、消毒，外侧正中切口切开皮肤和软组织，钝性剥离骨膜，用线锯在跖骨中段锯取21 mm长的跖骨干缺损，包括附着在骨干上的骨膜。无菌生理盐水冲洗骨缺损区，加压钢板固定，按实验要求植入材料，逐层缝合。术后头2 d动物放置在空调室内，禁止负重，2 d后开放性圈养，允许其在疼痛可忍受的程度下活动，羊饲料和流动水饲养。术后6、12、24周处死动物取材。

    124  荧光标记

    分别在处死前15 d和前7 d连续皮下注射四环素3 d，剂量50mg／kg。

    125  X线片分析

    术后即刻摄片，以后分别在第6、12、24周摄片。所有的X线片均由3个人单独进行放射学评价。主要根据X线片上骨与植入物界面的骨连接情况、植入物表面的骨痂生长情况和骨桥的生长情况进行评估。骨缺损区每面骨连接形成得1分，最低分0分（在缺损区的任一面上均无骨连接），最高分4分（缺损区的前、后、侧面及中央均形成骨连接）。记录骨痂达到最厚时的时间，并计算出6、12和24周时骨痂的平均厚度。

    126  生物力学测试

    测试过程按照标准程序进行〔4〕。收集标本后：立即去除软组织即可进行生物力学的测试。858Mini Bionix Ⅱ生物力学实验机（MTS，USA）上行垂直压缩试验，负荷10 N，速度10 mm／min。通过图表记录器可以获得一个压应变的曲线图，然后计算出每个标本的压缩应力及其弹性模量，再计算出平均的压缩应力和弹性模量。对侧正常的跖骨作为对照组。

    127  组织学及组织形态学分析

    分别在术后6、12和24周处死动物。将每个标本的中间部分（包含骨与植入物相连的2个界面）切下来固定在10％的甲醛溶液中。脱钙切片标本置于10％的甲酸中脱钙，梯度酒精逐级脱水、清洗、石蜡包埋，Masson三色染色和天狼星红染色（需在偏振光显微镜下观察）。不脱钙切片标本在4％的中性多聚甲醛液中固定2周后，用流动水冲洗12 h，再用梯度丙酮逐级脱水，-20 ℃下聚甲基丙烯酸甲酯包埋。等聚甲基丙烯酸甲酯凝固后在低温下切片，切片厚200～300 μm，用胶水将切片粘在一个塑料支架上，手工将它磨至（50±51）μm，直接在荧光显微镜下观察。然后用超薄切片机把剩余的标本切片，切片厚15 μm，直接在光学显微镜下观察。

    128  统计学分析

    所有数据均采用平均值±标准差表示，采用单因素方差分析。P＜005代表差异有显著性。SAS612统计软件进行统计学处理。

    2  结  果

    21  放射学分析

    术后即刻摄片能清楚地分辨出宿主骨与植入物，并看到它们之间的透亮带。随着新骨的形成，陶瓷材料变得越来越小，并且透光性增加。术后6周，第2组β磷酸三钙陶瓷周围可见有斑块状不透光区。12周后，骨缺损区由不透光的骨痂包绕。24周后，所有动物骨缺损区放射学检测显示为完全性骨连接，β磷酸三钙陶瓷颗粒几乎看不见（图1）。相比之下，第1组动物的骨愈合速度明显慢于第2组动物，24周时，多为不完全骨愈合（图2）。

    第2组动物，术后12周时骨痂最厚，随后骨痂厚度反而减小。但第1组动物，其骨痂厚度则不断增加，24周时才达到最大值。经测量每只羊骨缺损区骨痂的最大厚度及其平均值，可以看到，自体间充质干细胞植入对新骨生成具有明显的促进作用，其差别具有显著性（表1）。表1  放射学与生物力学评价

　　22  生物力学测试

    标本的抗压缩强度随时间逐步增加。24周后，第2组标本抗压缩强度接近正常骨的抗压缩强度。两组标本3个时间点间比较均具有显著性差异（P＜005）（表1）。第2组标本无论是抗压缩强度还是弹性模量均明显大于第1组动物标本，差别有统计学意义（P＜005）（表1）。

    23  组织学评估

    231  光学显微镜下观察

    2个实验组新骨生成情况在组织学上存在差异性。复合体植入骨缺损区12周后，第2组β磷酸三钙材料周围新骨生成较第1组多。大量的新生骨组织沿着陶瓷材料的孔隙及其连接径从材料的四周向中央长入，新生骨与陶瓷的两端紧密相连，就如X线片所见的一样，一个连续性的骨桥从骨断端长入陶瓷材料的孔隙中。在横切面和纵切面上都可以看到新生的编织骨和哈佛氏系统存在。新生骨与陶瓷材料的孔隙间很少有间隙和纤维组织存在，但偶尔有成骨细胞和巨噬细胞出现。在β磷酸三钙陶瓷的中央区域还可以看到块状的新生骨互相连接，将β磷酸三钙陶瓷分成数不清的小岛状，但陶瓷材料仍然存在。而第1组动物，只是在接近宿主骨端的陶瓷内有一定程度的骨生成，陶瓷的中央仍然空缺或由纤维组织填充。24周时，第2组动物植入材料的中央和表面都可见成熟的骨细胞和再生的板状骨，宿主骨和新生骨分界清晰（因为它们的骨纹理不同）。尤其令人惊讶的是，24周时该组动物标本切片极少能发现β磷酸三钙陶瓷的痕迹（图3、5）。第1组中，植入材料中只是偶尔有成熟的骨细胞出现，新生的编织骨，仍占主导地位，特别是在植入材料的中段。另外，还可见有少量的未吸收的陶瓷颗粒（图4、6）。

    232  偏振光显微镜下观察

    偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原表现为黄色、橙红色或红色的粗纤维，并且其颜色随纤维的直径大小变化，纤维越粗大，颜色越清晰；Ⅲ型胶原表现为细小的绿色纤维；Ⅱ型胶原显色微弱。第2组动物，术后6周骨折区主要由Ⅲ型胶原纤维占据；术后12周，Ⅰ型胶原纤维增加明显，但呈无序状排列；随着时间的增加，Ⅰ型胶原增多、增粗，并呈螺旋状排列；24周时，粗大的Ⅰ型胶原纤维占据了全部骨缺损区，排列更加紧密、有序。无论是横切片还是纵切片，细小的Ⅲ型胶原纤维都已看不见（图7）。第1组动物，术后12周骨缺损区以Ⅲ型胶原纤维为主，虽然Ⅰ型胶原纤维也有增加，偶尔还有Ⅱ型胶原纤维出现；但直到术后24周，Ⅲ型胶原纤维仍占据了骨缺损区的部分区域（图8）。

    233  荧光显微镜下观察

    四环素盐酸盐作为新生骨的特异性的标记物，能选择性地与钙盐结合，并沉积在新生的骨组织中。在荧光显微镜下，标记有四环素盐酸盐的新生骨组织发出明亮的金黄色荧光，每次标记表现为一条明亮的金黄色荧光带，两条荧光带间的空隙代表两次标记间新生的骨组织。实验结果显示，第2组荧光带亮度（图9）及其带间宽度都强于第1组（图10）。

    3  讨  论

    骨缺损修复的最大障碍就在于缺乏生成新骨所需的足够的骨诱导因子。绝大部分的修复反应都需要骨髓中成骨祖细胞参与，而骨缺损区往往缺乏成骨祖细胞和成骨细胞，因此常常修复能力不足导致骨折不愈合。

    常用的骨移植方式包括自体骨移植、异体骨移植和人工合成骨移植。异体骨来源充足但有些患者无法接受，而且疗效也欠佳。自体骨移植对患者来说来源有限且存在供区感染等风险。相比之下，组织工程化骨只需要少量的自体细胞就能制造出大块骨组织〔5〕，而且还避免了上述的问题。

    骨髓细胞中包括有造血干细胞和具有成骨能力的干细胞。100多年前就已知自体骨髓移植具有成骨潜能并成功地用其进行动物和人体骨缺损的修复实验。Goujon在1896年首次发现自体骨髓移植能生成新骨。Burwell及其他一些学者则用自体骨髓与自体骨、异体骨和陶瓷复合修复牙槽和骨缺损〔6、7〕。Connolly和Shindell也曾成功地进行自体骨髓注射治疗胫骨骨不连。但由于骨髓不能形成必要的机械连接，因而较少用其进行骨缺损填充再造或原发性或恶性骨肿瘤切除后重建。另外，由于难以在骨折区长期保留骨髓，临床单独应用骨髓治疗的成功率也不肯定。本研究中，第1组动物实验终末21 mm骨缺损仍未完全修复，进一步证实大节段骨缺损的修复需要大量有成骨潜能的祖细胞。因此，在临床运用骨髓细胞进行骨重建前应该增加其具有成骨潜能的祖细胞。

    虽然一些学者认为骨髓细胞本身就具有促进新骨形成的作用，但富集骨髓细胞中最有活力的成分——间充质干细胞才是最重要的。已有学者尝试过在鼠、兔、狗等动物体内用间充质干细胞作为骨移植物来修复骨缺损〔8〕。通过比较新鲜骨髓细胞和间充质干细胞的成骨能力，结果证实种植有间充质干细胞的陶瓷能促进新骨更快、更广泛形成。究其原因为间充质干细胞经培养扩增后数量巨增，成骨能力增强。附着在载体上的干细胞能在整个陶瓷上快捷、均匀地生成新骨。这种增加原始植入祖细胞的方法正是组织修复或再生所必需的。本实验最大的优点也正是增加了局部祖细胞的数量，使其达到组织修复或重建所必需的细胞数量，这对临床中许多骨髓源性成骨祖细胞减少的情况特别重要，其中包括年龄的增加、骨质疏松和其它的代谢性疾患〔3〕。由于细胞整体数量减少使得细胞库中可用于组织修复的细胞数量减少，而且还可能让这些患者处于损害性治疗状态（即为了修复组织而抽取患者一定量的祖细胞后对患者产生的损害）。而从患者体内抽取间充质干细胞培养扩增后再回植到特定的部位，既可以增加骨的生成，又克服了组织再生能力的自然性减弱。

    本实验的结果说明，间充质干细胞不仅在体外具有良好的增殖能力，回植入体内后仍然具有良好的成骨能力，不需经过软骨过程就能直接形成新骨，并且新骨生长均匀，与宿主骨融合良好，显示了间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞良好的应用前景。

    （本文附图见加页1）

    参考文献：

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    〔5〕  李章华，刘世清，廖文，等.组织工程化骨构建及其修复羊跖骨标准性骨缺损的放射学评估［J］.中国矫形外科杂志，2005，13（2）：134136.

    〔6〕  Blokhuis TJ,Wippermann BW,den Boer FC,et al.Resorbable calcium phosphate particles as a carrier material for bone marrow in an ovine segmental defect［J］.J Biomed Mater Res,2000,51:369375.

    〔7〕  Wippermann B,Donow C,Schratt HE,et al.The influence of hydroxyapatite granules on the healing of a segmental defect filled with autologous bone marrow［J］.Ann Chit Gynaecol,1999,88:194197.

    〔8〕  Petite H,Viateau V,Bensaid W,et al.Tissueengineered bone regeneration［J］.Nat Biotechnol,2000,18:959963.

   （1武汉大学人民医院骨外科，武汉  430060；2天津市天津医院创伤骨科，天津  300211

    3北京大学医学部积水潭医院，北京  100035  4军事医学科学院基础医学研究所组织工程中心，北京  100850）