以PHBV为支架构建组织工程化软骨

　　摘  要：［目的］探讨聚（羟基丁酸酯羟基戊酸酯）（PHBV）多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性以及体内外培养方式对软骨形成的影响。［方法］采用“压片-热处理-粒子析出”技术制备PHBV多孔支架。体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养2周，期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况，然后与单纯PHBV支架同植入裸鼠皮下继续培养4、8周后取材，与体外培养至6、10周的细胞-支架复合物同行组织学观察。［结果］电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质；组织学观察示PHBV浅层有新生软骨组织形成，且皮下培养的软骨组织比体外培养的更为成熟。单纯PHBV支架皮下培养没有软骨组织形成。［结论］PHBV可以作为软骨组织工程支架材料，体内培养较体外更有利于组织工程化软骨的形成。

    关键词：组织工程;  软骨细胞;  支架；  聚（羟基丁酸酯羟基戊酸酯）

    Macroporous PHBV matrices for cartilage tissue engineering∥WU Jun,SUN Junying,LI Haiyan,et alDepartment of Orthopaedics,the First Peoples Hospital of Changzhou,Jiangsu 213003,China

    Abstract：［Objective］To investigate the possibility of using poly（hydroxybutyratecohydroxyvalerate）（PHBV）as scaffolds for cartilage tissue engineering and to compare the engineered cartilage generated in vitro with those in nude mice modles［Method］PHBV porous scaffolds were fabricated using a compression moulding,thermal processing and salt particulate leaching methodsChondrocytes isolated from articular cartilage were seeded into porous PHBV scaffoldsAfter incubation for 2 weeks in vitro,chondrocytesPHBV constructs were implanted subcutaneously in the dorsum of athymic nude miceControl groups were established by subcutaneous implantation of PHBV aloneThe implants harvested after in vivo incubation of 4 and 8 weeks and cellscaffolds cultured in vitro for 6 and 10 weeks were respectively examined histologicallyChondrocytes cultured for 3,7 and 14 days on the scaffolds were examined by SEM［Result］SEM showed that chondrocytes could aggregate and synthesize extracellular matrix on PHBV scaffoldsBoth specimens harvested from nude mice and those cultured in vitro demonstrated new cartilage formation,while characteristics of the engineered cartilage generated in vivo were more typicalThose from control groups showed no cartilage formation［Conclusion］PHBV can be used as scaffolds for cartilage tissue engineering and nude mice modle seems to facilitate chondrogenesis compared with that in vitro system

    Key words：Tissue engineering;  Chondrocyte;  Scaffold;  PHBV

    聚（羟基丁酸酯羟基戊酸酯）（PHBV）是原核微生物在碳、氧营养失衡的情况下，作为碳源和能源储存而合成的一类聚羟基链烷酸，具有良好的生物相容性和机械强度，且其由生物合成，不含有化工原料合成过程中可能产生的对人体有害的一些副产品〔1〕。因此近年来受到重视，并在骨组织工程中得到应用〔2〕。但作为软骨细胞支架的研究尚未有文献报道。为此作者自行备制PHBV多孔支架并接种软骨细胞进行体外和裸鼠皮下培养，探讨其作为软骨细胞支架的可行性以及体内外培养方式对组织工程化软骨形成的影响。

    1  材料与方法

    11  实验材料和仪器

    DMEM培养基，胎牛血清，胰蛋白酶EDTA（Gibco公司）；Ⅱ型胶原酶（Sigma公司）；PHBV（宁波天安生物材料有限公司，分子量30万，40目过筛）；氯化钠（CR，中国医药集团上海化学试剂公司）；1 d龄大耳白兔、1周龄裸鼠由苏州大学医学院动物实验室提供；压片机（FY10粉末压片机，天津市科器高新技术有限公司）；真空干燥箱（DZF6020型，上海益恒实验仪器有限公司）。

    12  制备PHBV多孔支架

    采用“压片-热处理-粒子析出”技术制备PHBV多孔支架。即按1∶7的比重分别秤取一定量的PHBV粉末和NaCl颗粒混合，在球磨机上球磨30 min后模压成型，压力为10 Mpa，保压1 min。将柱状体置于180 ℃烘箱10 min后室温冷却，经去离子水浸泡72 h使NaCl溶解析出。将柱状体置于50 ℃真空干燥箱干燥48小时后备用。PHBV支架呈直径6 mm、厚3 mm的圆柱状，经测定孔径为200~300 μm，孔隙率约80%。

    13  软骨细胞的提取和培养

    取1 d龄大耳白兔经70%酒精浸泡30 min处死，无菌条件下取双侧髋、膝关节软骨，PBS漂洗后切碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入3倍体积的02%Ⅱ型胶原酶置于37 ℃,恒温摇床消化4~5 h，经150目铜网过滤离心，沉淀细胞用PBS漂洗后加入DMEM培养液（含10%胎牛血清，青霉素100 U／ml，链霉素100 μg／ml）制成细胞悬液，经台盼兰染色计数，示细胞活度＞90%；按（2~3）×104／cm2密度接种软骨细胞。置于培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养，隔天换液。生长至90%融合时以025%胰蛋白酶-002%EDTA消化传代。

    14  软骨细胞-PHBV支架复合物的体外培养

    PHBV支架经75%酒精浸泡消毒24 h，PBS及DMEM培养液各漂洗3次，紫外线照射下干燥至半湿状态。取第3代软骨细胞制成浓度为50×106／ml的细胞悬液，每个支架滴加悬液50 μl后在培养箱中培养，待细胞充分吸附在支架上后加入4 ml DMEM培养液继续培养，每3 d换液，培养至10周。

    15  扫描电镜观察

    分别取体外培养3、7、14 d的细胞-支架复合物经PBS漂洗、25%戊二醛固定后，常规扫描电镜制备标本行扫描电镜观察。

    16  软骨细胞-PHBV支架复合物的裸鼠皮下培养

    无菌条件下，6只裸鼠背部两侧皮下各植入一个体外培养2周的细胞-支架复合物和单纯PHBV支架，分别作为实验组和对照组，按照标准实验动物饲养法饲养8周。

    17  组织学观察

    分别取体外培养6、10周的细胞-支架复合物及裸鼠皮下培养4、8周的复合物经PBS漂洗、10%甲醛固定，常规石蜡包埋，行HE染色、Safranin“O”染色和Massons三色染色。PHBV支架对照组行HE染色。

    2  结  果

    21  扫描电镜观察

    细胞-支架复合物体外培养3 d，软骨细胞呈球形葡萄状黏附在支架表面；培养至7 d，细胞在支架表面伸出伪足、呈“鸭蹼”状黏附，并可见细胞分泌的基质沉积于细胞周围；培养至14 d，细胞基质量明显增多，呈网状分布于支架表面（图1）。

    22  大体观察

    细胞-支架复合物和单纯PHBV支架在培养期间外形均保持良好，无明显塌陷及形变，但纵切面示支架结构均变得松散。体外及体内实验组支架浅层有新生软骨样组织形成，厚度分别为1 mm和15 mm左右。对照组无软骨样组织形成。

    23  组织学观察

    细胞-支架复合物体外培养6周，HE染色示部分较小的软骨陷窝形成，软骨细胞形态尚不典型；10周时软骨陷窝多见，软骨细胞大部分成熟，呈圆形或椭圆形，分布不均匀；细胞-支架复合物裸鼠皮下培养4周，软骨组织较同期体外培养的组织发育更为成熟，软骨陷窝明显，软骨细胞形态基本正常，排列规则，细胞已达5层左右；体内培养至8周，软骨组织基本成熟，可见典型的陷窝样结构，软骨细胞增殖明显、排列密集，软骨形成的范围向深部扩大，细胞层次增至15层左右，更多异染的基质分布在细胞周围。体内对照组4周及8周的HE染色示支架孔隙内为炎性细胞浸润，无软骨组织形成（图2）。

    各时期体外、体内取材组织的Safranin“O”染色均呈阳性反应，表明软骨细胞分泌糖胺多糖（GAG），并随培养时间延长GAG含量逐渐增多（图3）。Massons三色染色示，体外培养至6周时胶原集中分布在组织浅层，10周时胶原纤维束向细胞间质中扩展；而体内培养至4周时软骨基质富含胶原，分布较为均匀；8周时随着软骨组织向深部生长，胶原亦向纵深扩展（图4）。另外，体内培养的软骨基质中GAG和胶原含量较同期体外培养的组织明显增多。

    3  讨  论

    目前常用于软骨组织工程的支架材料主要有两类，即合成高分子材料，如聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）和两者的共聚物（PLGA）；天然高分子材料，如胶原、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白以及琼脂糖等。合成高分子材料对组织来说是种异物，降解产物呈酸性，且亲水性较差，对细胞吸附不足;天然材料在制备支架过程中可控性较差，易出现性能和结构的变化。因此寻找新的支架材料成为当前研究的重点。

    PHBV是原核微生物在碳、氧营养失衡的情况下，作为碳源和能源储存而合成的一类聚羟基链烷酸，在生物体内可以完全降解，最终产物为二氧化碳和水。与天然高分子材料相比，具有良好的机械性能；与合成高分子材料相比，又有良好的组织相容性，且其由生物合成，不含有化工原料合成过程中可能产生的对人体有害的一些副产品〔1〕。因此近年来PHBV受到重视，并在骨组织工程中得到应用〔2〕。但作为软骨组织工程支架的研究尚不深入，因此作者制备PHBV多孔支架并接种软骨细胞进行体内外培养。

    体内外培养期间PHBV支架外形保持良好，没有明显塌陷及形变，软骨细胞在PHBV支架上生长良好，能黏附并分泌细胞外基质，表明PHBV支架具有较好的机械强度和生物相容性。组织学观察示随着体外和裸鼠皮下培养时间延长，软骨陷窝逐步形成，软骨细胞趋于成熟，细胞分泌的GAG、胶原等基质含量逐渐增加，新生软骨组织日趋成熟，表明PHBV可以作为软骨细胞支架。实验表明，裸鼠皮下培养的软骨组织较同期体外培养的组织更为成熟，皮下培养8周，软骨陷窝和软骨囊等软骨组织的基本特征比较明显，软骨结构发育比较成熟;而体外培养至10周时新生软骨组织基本特征尚不典型，表明了体内外培养方式对软骨发育成熟的影响。造成这种差异的原因可能与体外培养期间软骨细胞分泌的蛋白多糖流失有关。Sittinger〔3、4〕等认为，体内培养时，软骨细胞分泌的大分子固守在细胞周围，有利于基质的整合；而体外培养时培养液与组织大分子之间没有屏障保护，细胞分泌的大分子容易弥散到培养液中，不利于基质形成。另外，这种差别也与力学环境有关。裸鼠皮下培养时受到皮肤张力的刺激，而应力环境能够促进软骨细胞合成蛋白多糖，进而影响软骨组织的成熟〔5〕。本研究表明，PHBV可以作为软骨组织工程支架材料，且裸鼠皮下培养较体外培养更有利于组织工程化软骨的形成。

    另外，大体观察及组织学染色表明新生软骨主要分布在PHBV支架浅层。这一方面与PHBV亲水性欠佳〔6〕导致细胞难以渗入支架深层有关，也与PHBV为预制成型的多孔支架有关〔7〕。其次，实验组和对照组支架在培养期间均无明显塌陷及形变，支架结构变得松散但基本完整，表明10周期间PHBV没有完全降解。较慢的降解速度虽然有利于保持支架强度和孔结构，但会影响新生组织的长入。PHBV的降解速度与其分子量和聚羟基丁酸酯／聚羟基戊酸酯的复合比例有关。本次实验所用PHBV的分子量较高而羟基戊酸酯（HV）的比重偏低（3 mol%）。通过选择分子量较低的PHBV、提高HV的比重〔8〕，或者将藻酸钠、糊精、淀粉糖等与PHBV复合〔9〕均能促进PHBV的降解；而将PHBV与亲水性材料复合或对其进行表面修饰，则有可能提高PHBV的亲水性和对细胞的黏附能力，这些都为改进PHBV支架的性能提供了思路和方法，从而有利于提高组织工程化软骨的质量。

      参考文献：

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    〔9〕  Yasin M,Holland SJ,Tighe BJ.Polymers for biodegradable medical devices V.Hydroxybutyratehydroxyvalerate copolymers:effects of polymer processing on hydrolytic degradation［J］.Biomaterials,1990,11:451454.

   （1江苏常州市第一人民医院骨二科，213003；2苏州大学附属第一医院骨科；3中科院上海硅酸盐研究所生物材料中心）