IL1β、IL6、TNFα在兔腰椎软骨终板退变中的变化及作用△

【摘要】  ［目的］研究IL1β、IL6、TNFα在软骨终板退变中的作用。［方法］新西兰白兔24只随机分为实验组与对照组。实验组通过腰椎失稳而诱导了腰椎软骨终板退变动物模型。分别于术后12、24、36周摄腰椎X线片及扫描电镜观察，检测不同时段软骨终板中IL1β、IL6、TNFα含量。［结果］X线片示实验组较对照组钙化明显；Bradner指数示椎间隙高度随时间延长而逐渐降低；扫描电镜示实验组软骨终板随时间延长胶原纤维逐渐变细、排列紊乱、出现裂隙，蛋白多糖丢失加剧，上述变化较对照组显著；实验组IL1β、IL6、TNFα含量较对照组增多（P＜0.05）。［结论］IL1β、IL6、TNFα在软骨终板退变过程中含量相应增加，提示炎性细胞因子可能在软骨终板退变的形成和发展中起重要作用。

【关键词】  炎性细胞因子； 腰椎； 软骨终板； 退变

　　Role and change of IL1β,IL6 and TNFα during rabbit lumbar cartilage endplate degeneration∥

　　LIU Bin,JIN Dadi,QU Dongbin,et al.

　　Department of Orthopedics,the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University,Guangzhou 510630,China
   
　　Abstract：［Objective］To study the role of nitric oxide on the degeneration of the cartilage endplate(CEP).［Method］Twentyfour New Zealand rabbits were divided into experiment and control groups.In the experiment group,the model of lumbar CEP degeneration was established by resection of all lumbar supraspinous and interspinous ligaments,excision of parts of zygapophysial joints and detachment of the posterior paravertebral muscles from lumbar vertebraes.Mechanical instability of the lumbar spine could induced the process of CEP degeneration.The Xray examination of lumbar spine was examined by at 12,24 and 36 weeks with or without operation,respectively.Changes of the ultrastructure of CEP were also observed by scanning electron microscope(SEM) during this process,and the content of IL1β,IL6,TNFα in the CEP were also detected during the periods.［Result］Xray graph showed that the CEP calcified gradually with time increasing,and those of the experiment groups calcified more obviously than those of the control groups.The SEM showed that collagen fibers became thin,irregular and fissured and the content of proteoglycan decreased severely with the elapse of time.The changes in experiment groups were more obvious than those in control groups.The content of IL1β,IL6,TNFα had a significant difference between the experiment groups and the control groups(P＜0.05).However,there was no significant difference between 24 and 36 weeks in the experiment groups(P＞0.05).［Conclusion］It implies that inflammatary cytokin may play an important role in the development and progression of the degeneration of cartilage endplate.
   
　　Key words：inflammatary cytokin;  lumbar vertibrae;  cartilage endplate;  degeneration

　　椎间盘退行性疾患是脊柱常见病之一。其退变的确切机理至今仍不十分清楚，但有证据表明椎间盘的退变源于软骨终板退变〔1～3〕。IL1β、IL6、TNFα作为炎性细胞因子，在椎间盘退变过程发挥重要作用，但在软骨终板退变中的作用尚未见报道。本文通过力学失稳造成腰椎软骨终板退变模型，研究炎性细胞因子在软骨终板退变中的作用，以探讨软骨终板退变的机理。
   
　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物
   
　　24只清洁级新西兰白兔，雄性，6～8个月龄，体重2.5～3.0 kg，由南方医院动物实验中心提供。
   
　　1.2  试剂及仪器
   
　　IL1β、IL6、TNFα检测试剂盒由解放军总医院放免研究所提供。KXO 15R型X线机（Toshiba公司，日本），S-450扫描电镜（Hitachi公司，日本），液闪计数仪（Beckman LS -6500，美国）。
   
　　1.3  动物模型及分组
   
　　24只新西兰白兔，随机分为手术组12只，对照组12只。手术组用10%水合氯醛20 mg/Kg静脉麻醉后，取俯卧体位，备皮，碘酒、酒精消毒，铺巾。沿L1～7棘突做后正中切口，长约10 cm，贴棘突两侧切断椎旁肌附丽，分离附着于棘突、椎板及小关节的肌肉，暴露棘突、椎板和关节突。依次切除L1～7的棘上、棘间韧带及两侧关节突关节后外1/2，依次缝合各层组织。对照组动物仅切开皮肤后不作肌肉分离及韧带切除。术后动物在笼中自由活动〔4〕。分别于术后12、24和36周处死动物取材。
   
　　1.4  X线检查
   
　　于术后12、24和36周取2组实验动物各3只行X线检查。观察软骨终板变化情况。并根据Bradner椎间盘指数观察椎间隙变化〔5〕（图1）。
   
　　1.5  扫描电镜观察
   
　　摄X线后处死动物，立即取出L5、6椎间盘。切开椎间盘，仔细刮除髓核、切除纤维环，显露软骨终板，将软骨终板置入2.5%新鲜预冷戊二醛4 ℃固定48 h，PBS漂洗3次，每次15 min，1%锇酸固定1 h，PBS漂洗3次，每次15 min；50%→70%→90%→100%→100%→100%丙酮梯度脱水置换，每次15 min；置入乙酸异戊酯中2 h，液态二氧化碳临界点干燥器内干燥25 min，粘样后真空喷金，在Hitachi S-450扫描电镜下观察。
   
　　1.6  IL1β、IL6、TNFα含量测定
   
　　按不同时段处死各组动物4只取出L3～4椎间盘后，切开椎间盘，刮除髓核、切除纤维环及软骨终板下骨组织，软骨终板称重。将软骨终板置于24孔培养板内，在37 ℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的DMEM 2 ml培养，72 h后取上清液，集中待测。用平衡法按放免检测试剂盒说明书操作，测定IL1β、IL6、TNFα含量。IL1β和TNFα结果以ng/mL表示，IL6结果以pg/mL表示。
   
　　1.7  统计学处理
   
　　实验数据以x-±s表示，用SPSS 10.0软件包进行统计学分析，样本均数间比较使用方差分析，P＜0.05具有统计学意义。
   
　　2  结果
   
　　2.1  X线片观察
   
　　X线片示，12周对照组的软骨终板无明显钙化，而12周实验组软骨终板钙化较明显；24周，实验组软骨终板钙化较12周明显，对照组软骨终板亦有轻度钙化；术后36周实验组软骨终板钙化明显，密度增高，而36周对照组的软骨终板虽然也发生钙化，但不如实验组明显。
   
　　据Bradner指数，椎间隙高度随时间延长而逐渐降低，其中12周对照组与实验组之间椎间隙高度无显著性差异（P=0.14），24周和36周实验组椎间隙高度较对照组明显降低（P=0.029；P=0.011），实验组12、24和36周椎间隙降低明显（P=0.011；P=0.029），对照组中，12周与36周之间有明显差异（P=0.001）（表1）。
   
　　表1  各组不同时段Bradner指数（略）

　　*实验组与对照组比较（P＜0.05）;▲36周对照组与12周对照组比较（P＜0.01）；#实验组各组内比较（P＜0.05）

　　2.2  扫描电镜观察
   
　　12周扫描电镜示，对照组软骨终板胶原纤维平行椎体上下面有规则的排列，胶原纤维之间的蛋白多糖排列紧密（图2），12周实验组软骨终板胶原纤维排列略显紊乱，且蛋白多糖已有丢失，胶原间出现孔隙（图3）；24周对照组软骨终板胶原纤维排列较12周对照组明显紊乱，且出现蛋白多糖丢失，而24周实验组胶原纤维排列更加紊乱，且胶原间孔隙明显增大；36周对照组软骨终板胶原纤维网排列松散，胶原间蛋白多糖丢失较明显（图4），而36周实验组胶原纤维排列无规则、纤维变细、断裂，蛋白多糖丢失明显（图5）。
   
　　2.3  软骨终板IL1β、IL6、TNFα含量的测定
   
　　随着时间的延长，实验组与对照组中IL1β、IL6、TNFα含量均升高，且实验组明显比对照组高（P＜0.05）；对照组内各时间段的IL1β、IL6、TNFα含量亦有显著性差异（P＜0.05）；而实验组中36周时IL1β、IL6、TNFα含量比24周时的含量增加不显著（P=0.10；P=0.41；P=0.21）（表2～4）。

　　表2  各时段软骨终板中IL1β含量测定（略）

　　*实验组与对照组比较（P＜0.01）；▲对照组组内比较（P＜0.05）;#实验组中各组与12周比较（P＜0.01）；△36周实验组与24周实验组比较（P＞0.05）

　　表3  各时段软骨终板中IL6含量测定（略）

　　*实验组与对照组比较（P＜0.01）；▲对照组组内比较（P＜0.05）;#实验组中各组与12周比较（P＜0.01）；△36周实验组与24周实验组比较（P＞0.05）

　　表4  各时段软骨终板中TNFα含量测定（略）

　　*实验组与对照组比较（P＜0.05）；▲对照组组内比较（P＜0.05）;#实验组中各组与12周比较（P＜0.05）；△36周实验组与24周实验组比较（P＞0.05）

　　3  讨论
   
　　无血管的椎间盘营养主要通过软骨终板中心部位扩散，而软骨终板的渗透能力随年龄增大而逐渐降低。目前尚不清楚软骨终板渗透能力的下降是由于物理因素、化学因素，还是软骨下骨组织血供的改变所引起的。不论何种因素都将影响椎间盘的营养输送造成椎间盘退变。只有全面了解了椎间盘退变机理，才可能进一步研究延缓甚或阻止其退变的方法。
   
　　3.1  椎间失稳与软骨终板退变
   
　　成年期人类椎体没有骨骺，这与鼠、兔等爬行动物不同。但动物与人椎体生长发育过程基本相似，都是通过椎体软骨不断钙化和骨化来增加椎体的高度〔6〕。引起椎间盘退变并非单纯压缩载荷，还有弯曲和扭转载荷，纤维环破裂也非纯剪切力造成，而是由弯曲、扭转和拉伸多种载荷复合作用的结果〔7〕。爬行动物与直立动物椎体的应力传导结构和方向及所受应力方式基本相同，其研究结果是有一定比较意义的〔8〕。
   
　　椎骨、椎间盘和脊柱韧带维持椎间关节稳定和平衡的作用为静力平衡，而脊柱周围肌肉、肌腱及内压维护椎间关节稳定和平衡的作用为动力平衡〔9〕。本实验切除兔腰椎棘上、棘间韧带及部分关节突关节，并分离腰椎椎旁两侧肌肉，破坏腰椎的动、静力平衡，造成椎间失稳，经12～36周后诱发软骨终板退变。随着时间的延长，实验组软骨终板钙化程度逐渐加重，钙化明显。36周时实验组软骨终板钙化已相当明显；椎间隙高度随时间的延长而逐渐降低，不同时段2组间具有显著差异。这主要是由于软骨终板钙化导致椎间盘营养供应下降，继而诱发和加重退变，椎间盘组织脱水高度降低使实验组较对照组椎间隙更窄。可以认为本实验所用的椎间失稳造模方法可造成软骨终板退变。
   
　　3.2  炎性细胞因子与软骨终板退变
   
　　目前研究表明，椎间盘内存在着调节基质代谢的酶系统，在椎间盘退行性变过程中，各种降解酶的活性升高，对相应的底物产生分解、破坏作用，从而加剧椎间盘的退行性变，尤其是基质金属蛋白酶在椎间盘退行性变中起重要作用。
   
　　软骨终板为透明软骨，其基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白多糖（PG）组成，而由基质所维持的正常分解和合成代谢对于其生物学功能至关重要。本实验检测软骨终板中的炎性细胞因子，发现IL1β、IL6、TNFα含量随时间延长而增高，实验组较对照组增高明显。扫描电镜观察，正常力学环境下，增龄因素对软骨终板胶原和PG代谢影响较小，而异常生物力学环境则可直接导致终板PG含量的不断减少及胶原纤维的变性。但不论是增龄或退变，PG的减少和胶原纤维网紊乱均与软骨终板退变的程度成比例，即应力作用时间越长，PG减少越为明显，胶原纤维排列愈加紊乱，软骨终板的退变程度也越为严重〔10〕。因此，异常应力可导致IL1β、IL6、TNFα含量增加，而炎性细胞因子可诱导基质金属蛋白酶的高水平表达，从而引起软骨终板基质的PG丢失，胶原破坏。由于PG带有硫酸基和羧基的负电荷，其含量急剧减少引起终板钙化，生物力学性能改变，进一步加重了软骨终板退变。
   
　　实验组24周后炎性细胞因子含量增高不明显，说明24周基本已达至较高水平，其后会保持在一定的水平上，24周后PG和胶原含量仍继续减少，说明除炎性细胞因子加速软骨终板基质破坏外，仍有其他因素影响着软骨终板退变。本实验未对36周后继续观察，此后各项指标变化有待于进一步研究。
   
　　本实验结果表明，IL1β、IL6、TNFα在软骨终板退变中发挥了一定促进作用。调控软骨终板中炎性细胞因子的含量以达到预防和延缓椎间盘退变可能是一个新途径。
   
　　图1X线片示Bradner椎间盘指数（略） 

　　A.椎体最大高度；B.椎间盘前侧高度 

　　图212周对照组软骨终板胶原纤维有规则的排列，胶原纤维之间的蛋白多糖排列紧密  （扫描电镜  ×5 000） （略）

　　图312周实验组软骨终板胶原纤维排列略显紊乱，且蛋白多糖已有丢失，胶原间出现孔隙  （扫描电镜  ×5 000）（略） 

　　图436周对照组软骨终板胶原纤维网排列松散，胶原间蛋白多糖丢失较明显  （扫描电镜  ×5 000）（略） 

　　图536周实验组胶原纤维排列无规则、纤维变细、断裂，蛋白多糖丢失明显  （扫描电镜  ×5 000）（略）

【参考文献】
  　　〔1〕 彭宝淦，贾连顺，施杞，等.软骨终板在椎间盘退变过程中的作用机理［J］.中国矫形外科杂志,2000，7（2）:147150.

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　　〔9〕 Fraser RD,Bleasel JF,Moskowitz RW.Spinal degeneration:pathogenesis and medical management.In:Ducker TB,Hadler NM,Kostuik JP,et al. ［M］.The Adult Spine:Principles and Practices,2nd ed.Philadelphia:LippincottRaven,1997,735739.

　　〔10〕 刘斌，瞿东滨，金大地，等.兔软骨终板退变过程中超微结构的观察［J］.中国临床解剖学杂志,2004，22（4）:398401.

作者单位：（中山大学附属第三医院骨科，广州 510630；南方医科大学南方医院脊柱骨病外科，广州 510515）