人骨形成蛋白7基因修饰的兔骨髓基质干细胞异位成骨实验△

【摘要】  ［目的］通过人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein 7，BMP7)基因修饰的兔骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)与聚乳酸-羟基乙酸(polycleclidecoplycoclide,PLGA)支架复合，进行自体皮下异位成骨实验，探索BMP-7基因治疗与组织工程技术相结合的可行性。［方法］PLGA与腺病毒Ad-BMP-7感染后的兔MSCs共培养，电镜观察了解细胞在PLGA上黏附、生长和合成分泌骨基质成分的情况；将转染基因的细胞和未转染基因的细胞分别与PLGA支架复合，构建组织工程化骨并植入体内，通过组织观察新骨形成情况。［结果］制备得到的PLGA为疏松多孔的网格样结构，具有一定的韧性和强度。将腺病毒感染的骨髓基质干细胞接种于修剪成一定形状的PLGA上，经电镜观察可见细胞贴附于材料表面和孔隙内并增殖。异位成骨实验证实空白对照PLGA孔隙内无新骨形成，对照细胞组内有部分新生骨形成，而AdBMP7实验组形成的新生骨组织面积更大(P<0.05)。［结论］应用hBMP7基因修饰的MSCs作为骨组织工程的种子细胞，可望取得更强的成骨能力。

【关键词】  基因治疗； 骨形成蛋白； 组织工程

△国家自然科学基金重点项目资助(基金号：303306101)

　　Ectopic bone formation induced by hBMP7 gene modified mesenchymal stem cells in rabbits∥

　　YAN Lu，LUO Erping,YU Bing,et al.

　　Center of Rehabilitation,Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University of Chinese PLA.Xi'an 710032,China
   
　　Abstract：［Objective］hBMP7 gene therapy combined with tissueengineering techniques was explored to improve osteogenesis in an ectopic bone formation model in rabbits.［Method］PLGA(with diameter of 150～300 μm and porosity of 90%) was prepared and autologous bone marrow stromal cells(bMSCs) infected by adenovirus carring hBMP7 gene(AdBMP7) were seeded onto it.Scanning electronic microscoping were used to observe cellmatrix interaction.The cells infected and noninfected were combined with PLGA at a concentration of 5×106cells/ml to construct tissueengineered bones respectively.They were further implanted into 8 rabbits subcutaneously using PLGA as blank control(8 implants per group). Six weeks after surgery, the implants were evaluated with histological staining and computerized analysis of new bone formation.［Result］PLGA prepared was a gridlike porous structure, with definite ductility and strength,and could be trimmed into different models. Adenovirusinfected MSCs seeded onto PLGA showed high level of proliferation, and mass synthesis of cell matrix was observed with electronic microscoping.In the ectopic bone formation model, PLGA alone could not induce new bone formation. The new bone area formed in the noninfected MSCs group was 28.6±6.1%,while AdBMP7 group was 57.5±5.7%,which was higher than that of the former significantly(P<0.05).［Conclusion］hBMP7 gene modified MSCs could enhance ectopic new bone formation in rabbits. These results indicated that the infection of MSCs with hBMP7 adenovirus might be suitable for bone tissue engineering applications.
   
　　Key words：gene therapy；  bone morphogenetic protein；  tissue engineering

　　由支架材料、种子细胞和生长因子复合构建的组织工程骨为临床治疗顽固性的骨折不愈合和大型骨缺损带来了希望。然而，如何实现生长因子在特定的解剖部位持续稳定的释放，这个问题一直未得到有效解决。骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有明确的成骨潜能，是骨愈合过程中骨化的重要细胞。它具有来源丰富，采集方便，容易在体外培养、诱导、扩增的特点，是组织工程化骨理想的种子细胞。该细胞在体外培养具有较强的传代增殖能力，外源目的基因易于导入，因此也是骨缺损基因治疗较为理想的靶细胞［1］。本实验利用腺病毒介导hBMP7基因转染MSCs并与具有良好生物相容性和生物降解特性的聚合物PLGA复合，构建组织工程化骨，并进一步进行兔自体皮下异位成骨实验，以探讨BMP7基因治疗与组织工程技术相结合，促进成骨的可行性。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料
   
　　PLGA由中国科学院成都有机化学研究所制备。将聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物按75∶25比例制成，孔径150～300 μm，孔隙率约90%。 新西兰大白兔（2月龄）8只，清洁级，购自第四军医大学实验动物中心。

　　1.2  方法

　　1.2.1  PLGA的准备
   
　　PLGA（中国科学院成都有机化学研究所）分别制成直径0.8 cm，长度1.5 cm大小的圆柱状，制作PLGA 的具体方法是：将聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物按一定比例制成浆料，通过生物材料快速成形机，由计算机控制各喷头的扫描运动和挤压/喷射运动，经低温堆积和冻干成具有大孔和微孔结构的载体支架。此支架具有可控的降解时间、孔隙率及满足个体化设计的要求等优点。预湿：PLGA以70%乙醇浸泡1 h，蒸馏水换洗乙醇。干燥后密封包装，环氧乙烷消毒备用。

　　1.2.2  种子细胞与PLGA复合体的形成
   
　　取第1代健康旺盛的兔MSCs，在其培养液中加入携带有BMP7外源性目的基因的腺病毒液［2］，病毒感染后常规培养3 d。用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，1 000r/min离心5 min，弃去原培养液，加入0.2 ml DMEM培养液，重悬后以5×106/ml浓度种植于大小为3 mm×3 mm×1 mm的灭菌PLGA上。37℃，5％CO2条件下孵育1 h，待MSCs贴附于PLGA上，再加入多量DMEM培养液，每2 d换液1次，常规培养。

　　1.2.3  相差显微镜观察
   
　　将种子细胞和细胞支架复合体培养，分别于2、4、6、8 d观察种子细胞的形态变化及在PLGA上的增殖和分化情况。

　　1.2.4  扫描电镜观察
   
　　分别于2、4、6、8 d取与PLGA共培养的MSCs和PLGA复合体，3%戊二醛固定，扫描电镜观察MSCs和PLGA结合情况。

　　1.2.5  组织工程化骨的构建及体内异位植入实验
   
　　将上述AdBMP7转染的MSCs传代细胞同上法用胰酶消化收集，重悬后以5×106/ml种植于4 mm×4 mm×2 mm灭菌PLGA材料块上，复合培养72 h后备用。取2个月龄健康新西兰大白兔，在无菌条件下分别将转染及未转染细胞与支架材料复合物植入兔自体背部皮下，实验同时植入单纯PLGA作对照，做好标记。术后6周取材，10%中性福尔马林液固定，混合脱钙液脱钙，石蜡包埋，切片行HE染色观察骨组织形成情况。利用病理图文分析系统进行成骨面积定量分析，标本沿最大径连续切片，每个标本随机取4张，分别测量新骨成骨面积和截面总面积，并计算新骨形成百分比，数据以±s表示。数据处理采用随机化配对设计资料的t检验，P<0.05为显著性标准。

　　2  结果

　　2.1  PLGA大体及扫描电镜观察
   
　　可见制备的PLGA呈泡沫状，并且有一定的弹性和韧性，易于修整成不同形状。PLGA在扫描电镜下为网格状，孔隙大小不等且相互交通， 呈疏松的连通孔结构(图1)。

　　2.2  MSCs与PLGA复合体光镜及扫描电镜观察
   
　　与细胞培养4 d时，细胞在材料表面生长，多为圆形和类圆形，开始向孔内或跨越微孔表面生长；培养8 d时，细胞数量大为增加，表面伸出突起，长短不一，跨越微孔表面，形成细胞间连结，细胞连接成片，相互拥挤，有大量基质形成，覆盖微孔表面(图2)

　　图1  PLGA扫描电镜(×150)（略）

　　图2  MSCs与PLGA复合体扫描电镜(×700)（略）

　　2.3  组织工程化骨体内异位成骨的观察
   
　　全部动物均成活，伤口无感染，红肿及伤口裂开等不良反应，伤口Ⅰ期愈合。

　　2.3.1  大体观察  取材顺利，全部植入材料完整无移位，与周围组织有轻度黏连，材料取出后附着处有轻微渗血。

　　2.3.2  组织学观察  兔自体皮下植入后6周，各组标本均未见明显的炎症反应，HE切片PLGA空白组材料未见新骨形成，材料内部主要为丰富纤维组织和小血管长人(图3)；而AdBMP7基因转染组材料中新生骨软骨样组织较多，骨细胞成熟，并可见大量成熟编织骨，骨小梁结构出现，可见髓腔形成(图4)，单纯MSC与PLGA复合材料组中有部分新骨或新生软骨形成，但成熟程度及成骨量均较转基因组差 (图5)。

　　图3  单纯PLGA植入后6周(HE染色×100)（略）

　　图5  单纯MSCs与PLGA复合体植入后6周(HE染色×100)（略）

　　图4  转基因MSCs与PLGA复合体植入后6周 (HE染色×100)（略）

　　2.3.2  成骨面积定量分析结果 计算机新骨成骨量单纯MSC与PLGA复合材料组为(28.6±6.1)%，而AdBMP7基因转染组为(57.5±5.7)%，成骨量明显大于前者(P<0.05)。

　　3  讨论
   
　　骨髓基质细胞能够向成骨细胞转化，具有明确的成骨能力。但单纯体内植入细胞并不能有效地形成新的组织，其主要原因在于以液态形式注人体内的细胞在局部微环境的作用下，无法保持局部有效浓度，导致新生组织数量下降。利用组织工程学方法选用适宜的细胞载体，能为细胞提供黏附及生长繁殖的空间，使之在相对稳定的环境中发挥作用有利于组织的再生［3］。组织工程对细胞载体的要求有［4］：(1)良好的生物相容性。无毒、不致畸，有利于细胞的黏附、增殖，无毒害作用，不引起炎症反应；(2)适宜的生物降解性。基质材料降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性作有效调控；(3)有效的表面活性。有利于细胞黏附，并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境，能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞的表型表达；(4)一定的可塑性。便于加工成型所需的形状，并有一定的机械强度，在植入体内一定时间内仍可保持其形状，从而使形成的组织具有所需的外形；(5)具有三维多孔结构。基质材料具有多孔性和高孔隙率，孔隙率最好达90%以上，内表面积大，既有利于细胞的黏附和长入，又有利于营养成分的渗入和代谢产物的排出。
   
　　目前在组织工程研究中常用的细胞载体包括天然和人工生物材料。天然聚合物包括胶原、脱钙异质骨等。由于天然材料有一定压缩性，在体内水解过程中不能保持空间构型、体内吸收过快，使其不适于骨组织工程。人工合成的聚合物包括有机材料和无机材料。有机材料有以PLA、羟基乙酸（PGA）、聚羟乙酸-乳酸(PLGA)为代表的聚酯和多聚糖钙藻盐水凝胶（Polymerizing calcium alginategels）等。目前，选用何种材料作为MSC的适宜载体尚未有明确结论。 PLGA是具有一定机械强度和良好加工性能的生物降解材料，它在体内先降解成人体代谢产物乳酸，进一步分解成CO2和水，被吸收后通过呼吸系统排出体外，在体内植入时其降解与新生组织的生成同时进行并与温度、pH值、相对分子质量及结晶的程度看密切关系。而且，其生物降解性可以根据需要调节。是目前组织工程研究中常用的细胞载体，具有较好的应用前景。
   
　　影响MSCs与PLGA复合培养体体内成骨的主要因素有：(1)局部血运情况：在小血管丰富的地方，新生骨组织出现的时间较早，数量也较多，说明植入物周围丰富的血运对新生骨组织非常有利，能够为细胞提供充足的营养，使其进一步增殖分化，分泌细胞外基质，进而形成骨组织；(2)材料的孔径与孔隙率：材料的孔径与孔隙率与新生组织之间的关系十分密切，孔径>100 μm，孔隙率>90％ 是适宜的［5］。在本实验中使用的PLGA材料孔径>100 μm，孔隙率接近90％，在8周时可见较多骨组织形成。在实际应用中，不同材料有着不同的物理学特性，如果一味提高材料的孔隙率，其力学强度就会下降，降低了复合材料的支撑强度。如何解决这一矛盾尚仍然是材料学研究的重点；(3)移植细胞的密度：移植细胞的密度对新生骨组织有着直接的影响，细胞密度过低时，不能在早期形成足量的骨组织且材料的降解与骨的新生不能保持同步，使新生组织的力学强度减低。细胞密度过高则容易造成细胞堆积于某些固定区域，细胞间的空隙减少，不利于细胞的延展，不能有效地发挥成骨作用。在本实验中选择5×106/ml接种密度，在8周时有约50％的新生骨组织形成，说明此细胞密度是适宜的；(4) 生长因子的作用：在正常骨发生的过程中，骨组织的新生与生长因子的关系十分密切，并且许多实验已证明生长因子能够促进骨组织的新生。在组织工程化新生骨组织的发生过程中，生长因子不仅能够发挥诱导性成骨作用，也能够促进种子细胞的增殖分化，直接推动骨组织的形成［6］。已有实验证明生长因子与陶瓷类生物材料复合后能够高效地发挥成骨作用。因此设想将种子细胞+细胞载体+生长因子三者复合后植入体内，应能更快更多地形成骨组织［7］。
   
　　通过实验作者可以认为，虽然PLGA存在一定的缺点，但基本符合骨组织工程支架材料的要求，同时证明BMP7基因修饰的MSCs成骨能力较单纯MSCs明显增强。本实验把基因治疗与组织工程方法结合起来取得了良好自体异位成骨能力，可望为骨缺损的修复提供新的方法。

【参考文献】
  　　［1］ Jadlowiec JA,Celil AB, Hollinger JO.Bone tissue engineering: recent advances and promising therapeutic agents［J］. Expert Opin Biol Ther,2003,3(3):409-423.

　　［2］ 鱼兵,范清宇,马保安,等.人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达［J］.第四军医大学学报,2004,25(17):1537-1540.

　　［3］ 卜丽莎,李建军,高申,等.转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA／PCL支架体外构建组织工程骨［J］.中国矫形外科杂志,2004,12(9):677-679.

　　［4］ Kim BS,Mooney DJ.Development of biocompatible synthetic extracellular matrices for tissue engineering［J］.Trends Biotechnol,1998,16(5):224-232.

　　［5］ Sun JS,Liu HC,Chang WH,et al.Influence of hydroxyapatite particle size on bone cell activities: an in vitro study［J］. J Biomed Mater Res, l998,39(3):390-398.

　　［6］ 李建军,傅永慧,孙鸿斌,等.骨形态发生蛋白2基因治疗与缓释载体修复骨缺损的比较研究［J］.中国矫形外科杂志,2005,13(17):1334-1336.

　　［7］ Musgrave DS,Fu FH,Huard J.Gene therapy and tissue engineering in orthopaedic surgery［J］.J Am Acad Orthop surg,2002,10(1):6-15.

作者单位：(第四军医大学西京医院 康复诊疗中心;药剂科,西安 710032;第四军医大学生物医学工程系卫生装备教研室,西安 710032;第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所,西安 710038)