大鼠退变腰椎间盘组织的超微结构观察△

【摘要】  　　［目的］观察大鼠腰椎间盘退变动物模型中椎间盘组织的超微结构改变。［方法］32只SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组各16只。实验组采用手术方法以L3为中心切除棘突、关节突、棘上、棘间韧带，切断双侧竖棘肌。对照组仅切开皮肤后即缝合。术后8周，应用电镜技术对SD大鼠椎间盘组织进行详细的超微结构观察。［结果］对照组的椎间盘组织超微结构的病理改变不显著，而实验组表现为软骨样细胞减少，出现不同程度地退变、坏死，细胞器数目减少，细胞外周致密颗粒增多；基质中胶原纤维发生不同程度的变性、融合、扭结或钙化，胶原纤维束间裂隙增大；［结论］应用电镜观察腰椎间盘退变动物模型的超微病理改变，可为研究腰椎间盘疾患提供相关的实验依据。

【关键词】  椎间盘退变 超微结构 动物模型

　　Observation of ultrapathology in the rat model study of experimental lumbar intervertebral disc degeneration∥

　　CHEN Desheng,JIN Qunhua,ZHANG Yan.

　　Department of Orthopedics the Affiliated Hospital of Ningxia Medical College Yinchuan 750004,China
   
　　Abstract：［Objective］To observe the change of ultrapathology in the rat model study of experimental lumbar intervertebral disc degeneration.［Method］Thirtytwo SpragueDawley（SD）rats were divided into two guoups at random,including in the experimental group and the control group.The experimental group was incised through posterior approach along spinous process,resected below erector spinal muscle,the supraspinal and interspinal ligament and the posterior of the zygapophysial joint at the center of the third lumbar spine for providing the rat degeneration of lumbar intervertebral induced by mechanical instability state.The control group was just incised the skin.All of th rats were examined after eight weeks by electronmicroscope.［Result］There was no special ultrapathological characterization after operation in the control group,while in experimented group most chonduocytelike cells were degenerated or necrotic and their number decreased markedly,collagenous fibrils appeared various kinds of degeneration including fusion,twist and calcification,and there were gaps between the collagen bundles.［Conclusion］Observing the change in the rat model study of experimental lumbar intervertebral disc degeneration by ultrapathology,it can offer the experimental data studying tile degeneration of lumbar intervertebral disc.
   
　　Key words：intervertebral disc degeneration;  ultrapathology;  animal model

　　椎间盘退变是腰腿痛和下腰痛的重要原因之一，也是腰椎间盘突出症和其他腰椎疾患的病理基础。但椎间盘发生退变的机理尚未完全阐明，本文作者通过设计和建立一种新的腰椎间盘退变的动物模型，并从退变的腰椎间盘髓核组织中观察超微结构改变，通过对其病理改变的观察有助于探讨诱发椎间盘退变的因素，以发现可能延缓或防止退变的方法。为腰椎间盘退变的基础与临床研究提供相关的实验依据。
   
　　1  材料和方法
   
　　1.1  实验动物
   
　　选取清洁级SD（SpragueDawley）大鼠32只，雄性，平均月龄3个月，体重（350±50）g，随机分为实验组和对照组，每组各16只。由宁夏医学院实验动物中心提供。合格证号SCXK（宁）2005-0001，动物实验环境等级：清洁级。
   
　　1.2  动物模型的建立
   
　　采用6.5%的水合氯醛（购于宁夏医学院附属医院制剂中心），0.055 ml／kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将SD大鼠俯卧位置于操作台上，固定四肢，腰背部备皮并用脱毛剂脱毛，范围约4 cm×6 cm，消毒铺巾单，实验组SD大鼠沿腰背部棘突做后正中切口，切开皮肤后，沿骨膜下剥离，充分显露L1～6棘突、关节突及椎板。咬骨钳去除棘突、关节突，棘上、棘间韧带，切断双侧竖棘肌，依层缝合皮下筋膜、皮肤。对照组SD大鼠仅切开皮肤后即缝合。术后2组动物分别放入单独笼中饲养。术后每日青霉素20万U肌注，连续3 d。
   
　　1.3  电镜检查
   
　　SD大鼠在腹腔注射麻醉下行椎间盘切除术，迅速切取整个椎间盘组织先置于2%戊二醛固定，待使得髓核的蛋白组织彻底变性、凝固后再切取髓核组织（这样可保护髓核组织不被破坏并且能及时固定）2 h后，0.1 mmol/L二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，固定过夜。2%锇酸固定后，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片经醋酸铀和枸椽酸铅双重染色后，日本日立公司，H600型透射式电子显微镜下观察并摄片。
   
　　2  结果
   
　　2.1  对照组椎间盘组织的超微结构观察
   
　　2.1.1  类软骨细胞
   
　　细胞核卵圆形或圆形，核膜完整、光滑，异染色质比较丰富，细胞质内粗面内质网比较丰富并且有小的线粒体，散在分布糖原颗粒及少量的脂肪滴，细胞外常见细突起，其外有基质包围，未有明显的巢样结构（图1）。
   
　　2.1.2  脊索细胞
   
　　脊索细胞多为不规则形，细胞核内常染色质占优势，异染色质在核周围积聚呈深染状，核圆，可有伪足伸出，周围伸出许多绒毛状突起，细胞浆内分别大量的糖原颗粒，胞质内细胞器较多，可见正常或比较正常的粗面内质网、线粒体等细胞器结构，并且有少量空泡。细胞之间的间隙较大，有桥粒连接。细胞质内密布大量糖原颗粒，部分细胞内有空泡（图2）。
   
　　2.1.3  胶原原纤维
   
　　胶原原纤维排列整齐、规则，纵横交错，大小及方向一致。可见周期性横纹，着色均匀。胶原原纤维很少交织在一起，无团块样结构出现。多数直径中等，横纹可见，边缘光滑、清晰，内部结构清楚可见。未见到高电子密度细颗粒的钙化点（图3）。
   
　　2.2  实验组椎间盘组织的超微结构观察
   
　　2.2.1  类软骨细胞
   
　　细胞少见，多数呈现不同程度的退变或死亡，周围常有细胞周间质，形成明显的巢样结构。细胞内溶酶体明显增多，胞核扭曲，常染色质凝集成块，分布于核膜下或散在分布，胞浆基质密度加深、粗面内质网扩张、线粒体空泡化，整个细胞体积缩小。有的细胞呈凋亡改变，体积更小，核固缩成团或碎裂成多块，散在于胞质中，胞质模糊不清，在致密的无定形基质中见一些粗颗粒状物或空泡，胞膜不完整或缺如。退变细胞外周的巢增厚呈多层排列，致密颗粒增多，且二者随着细胞退变程度的加重而明显增多（图4）。
   
　　2.2.2  脊索细胞
   
　　细胞少见，多为不规则形，伸出许多大小不等的突起，形成许多空泡状结构。细胞核内异染色质明显增多，核膜欠完整，细胞浆内细胞器明显较少，肿胀、坏死，线粒体脱颗粒，并且有大量的空泡，严重的出现细胞核碎裂、溶解或固缩（图5）。
   
　　2.2.3  胶原原纤维
   
　　胶原原纤维排列较疏松，方向不规则，纵横交错，长短不一。多数粗细不等的胶原原纤维未见周期性横纹，交织在一起，有时亦可聚集成堆或成束，排列较紧密，其间出现较大的裂隙状空白区或稀疏带。发生变性的胶原原纤维可散在分布，但常融合成斑块，甚至成团或巨块，胶原原纤维缠绕盘旋而扭结呈毛线团或髓鞘状，亦可呈指纹状结构或堆聚成片块状，内部含较高电子密度的细颗粒的钙化点，边缘变粗糙模糊，横纹消失，内部结构亦模糊不清（图6）。
   
　　3  讨论
   
　　正常髓核的细胞成分较少，主要是脊索细胞和软骨样细胞2种类型。脊索细胞是一种残余的胚胎性细胞，随年龄增长而不断减少。细胞小而少，核深染，胞质中含有丰富的糖原颗粒，细胞多散在分布，彼此借细胞突起相互连接。脊索细胞多为不规则形，核圆，可有伪足伸出，周围伸出许多绒毛状突起，胞质内细胞器较多〔1〕。软骨样细胞为髓核中常见的细胞类型，一般认为它来自纤维软骨，其形态与功能大致和软骨细胞相同。细胞变成圆形或不规则形，胞质中含有明显的高尔基复合体和发达的内质网，以及大量的糖原颗粒和一些脂滴。随着细胞分泌活动增强，细胞外围逐渐出现胞周基质。胞周基质的成分有胶原原纤维，细丝和致密颗粒。胞周基质的密度随年龄而增大，它反映了细胞产物的堆积。由于髓核中缺乏血管，且经常受到挤压，故髓核切片中常见致密嗜锇团块。髓核中胶原原纤维可见明暗相间的横纹，胶原纤维彼此平行排列组成纤维软骨板。在纤维环板内的胶原纤维之间，还有纵形、斜形和环形走向的弹性纤维呈网格状分布，网的上下端分别固定于相应椎体的软骨终板中。此外，胞浆中的细胞器结构改变与髓核组织退变程度关系密切。线粒体是真核细胞中重要的细胞器之一，参与生命活动的能量供给，诸多生理活动均有其参与或在其体内完成。退变的髓核细胞内线粒体数量明显减少，严重者结构消失，说明细胞器的代谢功能较弱或丧失。粗面内质网参与蛋白的合成及基质的产生和修复。退变的髓核细胞内可见粗面内质网减少，严重者出现扩张、消失，提示细胞随着退变的加重而合成蛋白能力减少。而溶酶体出现在退变的髓核细胞中反映了细胞本身正在吞噬衰老坏死的细胞器〔2〕。
   
　　腰椎间盘髓核组织退变表现为细胞结构和功能及基质胶原原纤维的变化以及蛋白多糖、水含量的改变。在光镜下，因受分辨率限制，无法清晰观察，而电镜下超微结构观察可以较全面了解髓核组织的退变情况并有利于判断其退变程度〔3〕。退变椎间盘的本质是其细胞本身的功能退化、凋亡和坏死。目前许多研究证实椎间盘超微结构的改变与椎间盘退变程度相关〔4〕。本实验组中髓核组织细胞数量急剧的减少，软骨样细胞及脊索细胞均出现不同程度的退变，甚至凋亡或坏死，部分退变的细胞，体积明显缩小，染色质疑集、细胞核固缩、溶解或碎裂，浆基质致密，类似凋亡细胞的形态，由此可以推测髓核细胞的凋亡与椎间盘退变的关系密切。此外在实验组中髓核细胞的细胞器也发生明显的改变，如粗面内质网扩张、线粒体空泡化等改变，细胞器发生老化进一步说明髓核组织出现退变的进程。在退变细胞周围基质中可见较多致密颗粒及类似基质小泡的结构，可能与钙化密切相关，也说明与髓核退变程度有相关性。胶原原纤维退变是髓核组织的重要病变，其扭结成团的数量，可判断胶原原纤维变性的严重程度。诸多的原因和诱因可以使得椎间盘髓核组织发生不同程度的退变，而通过超微结构观察有利于判断椎间盘组织退变的性质和程度，为椎间盘退变的病因、发病机理及病程转化提供有力的理论依据。
   
　　因此本动物模型的建立可为脊柱腰椎退行性疾病和腰椎间盘病变的研究提供一个较为理想实验平台。
   
　　（本文附图见加页4）（略）

【参考文献】
  　　〔1〕 MikuniTakagaki Y，Suzuki Y，Kawase T，et al.Distinct responses of different populations of bone cells to mechanical stress［J］.Endocrinology,1996,137（5）：2028.

　　〔2〕 刘勇，胡有谷，陈晓亮.不同病理类型椎间盘突出组织的超微结构观察［J］.中国脊柱脊髓杂志，2003,13（7）:416418.

　　〔3〕 陈振斌，叶君健，谢其扬，等.椎间盘突出症髓核组织的超微病理观察［J］.电子显微学报,2002,21（4）：365368.

　　〔4〕 李晨光，王拥军，施杞，等.动静力失衡性大鼠颈椎间盘组织形态学及超微结构［J］.中国矫形外科杂志，2006,14（5）：356359.

△基金项目：宁夏回族自治区卫生厅科技计划重点项目（No.w200507）

作者单位：宁夏医学院附属医院骨科，银川 750004；宁夏医学院中心实验室