复方丹参缓释系统植入治疗股骨头缺血性坏死的实验研究

【摘要】  　　［目的］探讨磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）复方丹参缓释系统局部植入治疗股骨头缺血性坏死的机理。［方法］健康新西兰大白兔30只，制作股骨头坏死模型后，分为CPC组、CPC／丹参缓释系统组及对照组。于治疗后1、2、3和4周取标本，行HE染色和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）免疫组化染色，记录空骨陷窝率、VEGF阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率、VEGF阳性软骨细胞率。［结果］CPC／丹参缓释组空骨陷窝率较对照组及单纯CPC组明显降低，VEGF阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率、VEGF阳性软骨细胞率较其他2组明显增加（P＜0.01，P＜0.05）。［结论］CPC丹参缓释系统通过中药的局部缓释，可促进VEGF等细胞因子的分泌刺激血管内皮的增殖、分化，促进血管的生长和修复，从而改善、重建股骨头局部微循环，促进骨坏死修复。

【关键词】  股骨头坏死 磷酸钙骨水泥 丹参 局部应用

　　Experimental study on implantation of calcium phosphate cement/danshen drug delivery system for avascular necrosis of the femoral head∥

　　HUANG Xiangjie,JIANG Hongjiang,TAN Yuanchao,et al.

　　Department of Bonejoint Surgery,Wendeng Hospital of Traditional Chinese Orthopedics and Traumatology,Wendeng 264400,China
   
　　Abstract：［Objective］To explore the role of implantation calcium phosphate cement（calcium phosphate cement）/Danshen drug delivery system for avascular necrosis of the femoral head.［Method］The New Zealand white rabbits were randomly divided into CPC/Danshen group,CPC group and the control groups after the model of avascular necrosis of the femoral head have been copied.The animals were killed at 1,2,3,4 weeks respectively after operation,histological examination and VEGF immunohistochemistry stain were done to determine the change in different groups.［Result］Compared to CPC group and the control group,the ratio of empty osteocytes lacuna dramatically decreased in CPC/Danshen group,and ratio of positive VEGF reaction of vessel,osteoblast,chondroblast significantly increased（P＜0.01,P＜0.05）.［Conclusion］With local application of traditional Chinese medicine,this improved procedure can promote the express of VEGF and local angiogenesis,which will benefit reconstruction of the local microcirculation and repair of the necrotic femoral head.
   
　　Key words：osteonecrosis of femoral head;  calcium phosphate cement;  danshen;  drug delivery system

　　股骨头缺血性坏死是临床难治疾病，由于微循环障碍局部缺血，药物很难到达局部而发挥作用。因此采用药物局部缓释，保证局部药物高效、稳定、长期释放，对于治疗股骨头缺血性坏死尤为重要。本研究应用磷酸钙骨水泥（CPC）／丹参缓释系统植入治疗动物激素性股骨头缺血性坏死，观察中药的局部缓释对股骨头的微循环和骨性结构的影响，揭示CPC／丹参缓释系统治疗非创伤性股骨头缺血性坏死的机理。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  实验动物
   
　　纯种健康成年24周龄以上雄性新西兰大白兔30只，体重（2.5±0.5）kg，由山东省文登整骨医院骨伤科研究所实验动物中心提供，合格证号：鲁医实验动物准字05号。
   
　　1.2  主要仪器及试剂
   
　　大肠杆菌内毒素（LPS）：武汉博士德生物工程有限公司，10 mg／支；甲基泼尼松龙（MP）：浙江仙琚制药股份有限公司，5 ml／瓶（125 mg）；复方丹参注射液：上海中西药业股份有限公司，每安瓿2 ml，相当于丹参、降香各2 g；免疫组化染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，产品编号：SA1020小鼠／兔IgG，内容：（1）5％BSA封闭液;（2）二抗：12 ml;（3）SABC。血管细胞内皮生长因子（VEGF）：sc507 SANTA CRUZ；IX 50／IX 70倒置式系统显微镜：日本奥林巴斯（OLYMPUS）：PM20全自动显微照像设备；SPSS 10.0统计软件：北京盈科科技发展有限公司。
   
　　1.3  动物模型及复方丹参缓释系统的制备
   
　　1.3.1  动物模型
   
　　兔耳缘静脉注射50 μg／kg大肠杆菌内毒素（LPS），24 h后重复，在第2次注射LPS后，臀肌注射甲基泼尼松龙（MP，2.5 mg／kg）3次，每次间隔24 h。
   
　　1.3.2  复方丹参缓释系统
   
　　参照Makoto Otsuka、A.Ratier等〔1、2〕描述的药物CPC缓释系统制备方法，按预实验确定的复方丹参含量，每2 g CPC粉末加入复方丹参0.1 ml，先将复方丹参注射液与固相混合，再加入固化液充分搅拌混合，植入模具固化备用。
   
　　1.4  实验分组及方法
   
　　造模4周后将兔随机分为3组。CPC组（8只）：在3%戊巴比妥静脉麻醉下行右髋关节外侧切口显露股骨颈前上部，在临股骨头关节软骨缘处以2.5 mm钻头钻孔，用小刮匙向内侧潜行刮除股骨头上部关节软骨下病灶，造成一直径约4.0 mm骨腔，充填CPC。CPC／丹参缓释系统组（8只）：在CPC组手术方法基础上充填CPC／丹参缓释系统。对照组（4只）：在CPC组手术方法基础上不充填植入物。以上各组均治疗1次，并于治疗后1、2、3和4周各处死2只，分别取标本（对照组1只双侧，共2个标本）。取股骨头，沿中心孔冠状面剖成两半，置于体积分数为10%的甲醛溶液中固定48 h，脱钙、脱水石蜡包埋切片，分别行HE染色和血管内皮细胞生长因子（VEGF）免疫组化染色，记录单位面积内空骨陷窝率、VEGF阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率、VEGF阳性软骨细胞率，与对照组比较。
   
　　1.5  统计学处理
   
　　单位面积内空骨陷窝率、VEGF阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率等资料均利用SPSS 10.0统计软件包进行统计。多组资料间比较用F检验和t检验，相关分析用多元相关分析。以P＜0.05为差异有显著性意义，以P＜0.01为差异有非常显著性意义。
   
　　2  结果
   
　　2.1  一般情况
   
　　第1次注射LPS后，所有兔均出现不同程度的精神萎靡，毛发蓬松，二便不通或稀便，食量减少，活动迟钝，反应缓慢，并出现流清涕，呼吸、心跳加快。在第2次注射LPS和MP后，以上症状加重。在约1周后，各组兔食量开始增加，二便好转，活动增加，精神好转。第1次注射LPS后，有2只死亡。第2次注射LPS和MP后1周内，有4只死亡。
   
　　2.2  HE染色
   
　　造模后第4周时，股骨头病理切片上出现典型的骨坏死（图1），坏死区域主要位于股骨头靠近股骨颈的松质骨中。CPC／丹参缓释系统组：治疗后的1周起，可见空骨陷窝减少，坏死骨小梁表面的成骨细胞数目增多，小梁间有散在的破骨细胞，伪足不明显。随着时间的变化，成骨细胞的数目增多，功能活跃。同时可见破骨细胞贴附在坏死的骨小梁表面，周围有大量的伪足出现。CPC组：在治疗后的第1～2周，空骨陷窝的改变不明显。第3、4周起，出现空骨陷窝的减少。随着时间的变化，成骨细胞和破骨细胞的数目也呈增多的趋势。对照组：在不同时间段内组织学无明显变化。两实验组可见空骨陷窝率较对照组明显减少（P＜0.05，P＜0.01），CPC／丹参缓释组较CPC组也有减少（P＜0.05）（表1）。
   
　　表1  治疗后各组空骨陷窝率的比较（略）

　　注：与对照组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与CPC组比较：#P＜0.05，与对照组比较：☆P＜0.05

　　2.3  免疫组化染色
   
　　对免疫复合物沉积部位及免疫反应强度的观察，以在细胞膜、细胞质以及基质中出现黄棕色反应产物为阳性，CPC／丹参缓释系统组VEGF免疫阳性反应明显强于前2组，阴性技术对照标本以PBS替代生物素化羊抗兔IgG，标本上均无黄棕色产物（图2）。
   
　　各组VEGF阳性血管率见表2，CPC／丹参缓释组VEGF阳性血管率较对照组明显增多（P＜0.01，P＜0.05），较单纯CPC组也有增多（P＜0.05）。各组VEGF阳性成骨细胞率见表3，CPC／丹参缓释组VEGF阳性成骨细胞率较对照组明显增多（P＜0.01，P＜0.05），较单纯CPC组也有增多（P＜0.05）。

　　表2  治疗后各组VEGF阳性血管率比较（略）

　　注：与对照组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与CPC组比较：#P＜0.05

　　表3  治疗后各组VEGF阳性成骨细胞率比较（略）

　　注：与对照组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与CPC组比较：#P＜0.05   

　　各组VEGF阳性软骨细胞率见表4，CPC／丹参缓释组VEGF阳性软骨细胞率较对照组明显增多（P＜0.01，P＜0.05），较单纯CPC组也有增多（P＜0.05）。
   
　　表4  治疗后各组VEGF阳性软骨细胞率比较（略）

　　注：与对照组比较：★P＜0.05，★★P＜0.01；与CPC组比较：#P＜0.05

　　3  讨论
   
　　关于建立股骨头坏死模型方面的研究工作很多，对于研究股骨头坏死的发病机理及治疗方法具有重要意义。有多种方法建立股骨头坏死动物模型，但无论是双足动物还是四足动物，到目前为止还没有一种方法能够完全与人的骨坏死病程演化相一致〔3〕。制作ANFH动物模型所选动物有兔、大鼠，鸡等，制作方法有大量使用激素法、冷却法、外科手术法、口服甲维素及马血清、大肠杆菌内毒素联合激素法等〔4、5〕。大剂量应用激素制作模型的方法最为常用，但大剂量激素对于动物机体的打击是严重的。鉴于此本实验采用兔耳缘静脉低浓度注射（50 μg／kg）大肠杆菌内毒素（LPS），加小剂量甲基泼尼松龙造成兔激素性股骨头坏死模型。该模型性质稳定，制作方法简单，成功率高，在造模后的第4周，股骨头病理切片上可见典型的骨坏死，在研究中药治疗后骨微循环的改善是有价值的。
   
　　血管生成法治疗股骨头缺血性坏死，是近年来骨科领域的研究热点。血管生成（angiogenesis）是指从已存在的血管床中以出芽方式生长、形成新血管系统，许多研究表明，某些中药或中药复方对促进机体血管生成具有重要作用。中医学认为“气血相关”，因而某些行气活血的中药可能具有促血管生成作用，这为中药促血管生成作用奠定了理论基础，并已得到了应用〔6、7〕。张树成等利用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型，检测补肾活血和补肾调经方药对动物促血管生成的作用，结果显示，2种中药均可产生特异性的血管生成作用，明显促进血管生长，增加血管数目，促进血管生成作用增加55％～124％〔8〕。他们还以老年雌性金黄地鼠（符合老年肾虚症状）为实验动物进行2种中药的药理学研究，发现子宫组织血管生成作用明显增强，认为中药具有促血管生成的重要作用〔9〕。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是Ferrara等于1989年在牛的垂体滤泡星状细胞体外培养液中纯化出来的蛋白质，是目前所知道的最强促进血管生成的因子。VEGF是一种特异性促内皮细胞生长因子，它有4种分子形式存在（VEGF206，VEGF189，VEGF165，VEGF121），VEGF121为完全分泌型，VEGF165为部分分泌型，VEGF189和VEGF206与细胞膜结合难以分泌。但它们生物活性相似，都能特异促进血管内皮细胞增殖，促进新生血管和侧枝循环形成。
   
　　本实验通过CPC丹参缓释系统局部给药，使局部的细、小动脉及毛细血管扩张，并通过促进VEGF等细胞因子的分泌刺激血管内皮的增殖、分化，促进血管的生长和修复，加速缺血区的再血管化。实验组VEGF的阳性表达明显高于对照组，且阳性表达主要位于血管内膜，提示其主要促进血管内膜的修复，对于改善、重建股骨头局部微循环、促进坏死修复是有效的。
   
　　（本文附图见加页2）（略）

【参考文献】
  　　〔1〕 Otsuka M,Matsuda Y,Suwa Y,et al.A novel skeletal drugdelivery system using selfsetting calcium phosphate cement:physicochemical properties and drug release rate of bovine insulin and bovine albumin［J］.J Pharm Sci,1994,83（2）:255258.

　　〔2〕 A Ratier IR,Gibson SM,Best M.et al.Setting characteristics and mechanical behaviour of a calcium phosphate bone cement containing tetracycline［J］.Bio mater,2001,22:897901.

　　〔3〕 刘培林，夏仁云，张士杰.股骨头缺血性坏死造模的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2001，8（9）：889.

　　〔4〕 周强.糖皮质激素诱导性股骨头坏死模型的血管改变［J］.中华外科杂志，2000，38（3）：212.

　　〔5〕 洪加源.激素性股骨头坏死骨代谢变化的实验研究［J］.骨与关节损伤杂志，2001，16（5）：365.

　　〔6〕 叶建红，宁亚功.直腿抬高试验在股骨头坏死患肢功能评价中的应用［J］.中华物理医学与康复杂志，2002，24（10）：628629.

　　〔7〕 王蕾，吴志奎.促进血管生成活性研究在临床应用的新进展［J］.深圳中西医结合杂志，2000，10（3）：130133.

　　〔8〕 张树成，吴志奎，王蕾，等.补肾活血和补肾调经方药促血管生成作用实验研究［J］.中医杂志，2000，41（6）：369370.

　　〔9〕 张树成，呈志奎，沈明秀.补肾调经和补肾生血中药促进子宫组织血管生成的形态学观察［J］.中国中医基础医学杂志，1998，4（8）：3738.

作者单位：山东省文登整骨医院骨关节治疗中心，264400