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首页医源资料库在线期刊中国矫形外科杂志2007年第15卷第6期

两法提取皮质骨I型胶原的比较研究△

来源:《中国矫形外科杂志》
摘要:【摘要】目的]通过对两种方法提取的骨胶原产量及特性的比较,推荐一种较为理想的提取皮质骨I型胶原的方法。[方法]以猪皮质骨为原料,去除软组织后劈成小骨块,经酒精梯度脱水、无水乙醚脱脂、盐酸脱钙、甲醇:氯仿(1:1,v/v)再脱脂处理后,骨块软化。分别采用传统的碱溶法和自建的增强酶解法对脱钙骨基质粉处......

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【摘要】  目的]通过对两种方法提取的骨胶原产量及特性的比较,推荐一种较为理想的提取皮质骨I型胶原的方法。[方法]以猪皮质骨为原料,去除软组织后劈成小骨块,经酒精梯度脱水、无水乙醚脱脂、盐酸脱钙、甲醇:氯仿(1:1,v/v)再脱脂处理后,骨块软化。然后将软化的骨块在高速粉碎机上粉碎成脱钙骨基质粉。分别采用传统的碱溶法和自建的增强酶解法对脱钙骨基质粉处理,经溶解、离心、透析、冻干等操作提取皮质骨胶原。最后对增强酶解法所得产物进行鉴定,并对两种提取方法的效率及得到的产物的外观、黏度、凝胶固化性进行比较。[结果]增强酶解法所得胶原的氨基酸组成、蛋白电泳、相对分子量大小、最大光吸收波长均符合I型胶原特征;和碱溶法比较,提取率由(57.8±4.96)%提高到(94.04±0.55)%;其相同浓度(0.03%,w/v)醋酸溶液黏度测定,增强酶解法为3.71,碱提法为2.81;在37.0℃,pH值7.35~7.45条件下行凝胶固化性检测,增强酶解法所提胶原凝胶液约10 min可固化形成凝胶块,而碱提法所提胶原的溶液仍为黏性液体。[结论]增强酶解法提取的骨胶原是I型胶原;相对于碱提法,该法提取效率高,所得胶原纯度高、黏性好、固化性好,是一种较好的从猪皮质骨中制备I型胶原的方法。

【关键词】  皮质骨I型胶原; 增强酶解法; 碱溶法

  常用的提取I型胶原的原料为皮肤、肌腱,但它们均含有大量其它种类的胶原和非胶原杂质,提取时纯化操作复杂。骨中胶原含量丰富,且主要为I型胶原,具有成为制备I型胶原主要来源的潜能。本实验室分别采用传统碱溶法和改进的酶解法—“增强酶解法”从猪皮质骨中提取I型胶原,并对两种方法及产物进行比较,结果证明本实验室建立的增强酶解提取技术是一种较理想的骨胶原提取方法。

  1  材料与方法

  1.1  主要试剂和仪器
       
  胃蛋白酶(Sigma公司);盐酸胍(华美生物工程公司);SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳次高分子量标准蛋白质(上海生物制剂公司),甲醇、氯仿、冰醋酸、Na2HPO4、NaOH、HCL、Tris-HCL无水乙醚、NaCl等(重庆北碚化学试剂厂),Sigma 2-16离心机(美国Sigma公司),SAVANT MODULYO冷冻干燥机(美国SAVANT公司),高效大容量冷冻离心机(美国Bachman仪器公司),UV751GD紫外/可见分光光度计(上海分析仪器总厂),6300黄金系统高效氨基酸分析仪(美国Beckman公司),DYY-III-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂),ZF-4型kodak凝胶成像系统紫外透射仪(上海顾村光电仪器厂)。

  1.2  骨基质粉的制备
   
  取新鲜猪长骨,去除周围软组织、骨膜、骨端松质骨,刮除骨髓,然后将皮质骨劈成4cm2左右碎块。大量清水冲洗后,酒精(60%、70%、80%、90%、100%)梯度脱水、无水乙醚脱脂、1 mol盐酸脱钙、甲醇:氯仿(1:1,v/v)再脱脂处理,皮质骨块变软如橡胶。然后将软化后的骨块放入DS-1型高速组织粉碎机中,转速1 000 r/min,粉碎制成脱钙骨基质粉,备用。

  1.3  胶原的提取

  1.3.1  碱溶法
       
  将1 g猪DBM粉加入盛有100 ml 1.25mol NaOH溶液的烧瓶中,持续摇晃24 h,溶液变为微黄色浑浊物。用1mol HCl将溶液pH值调至4.0,液体变为乳白色颗粒状混悬液。2℃ 20 000 r/min离心30 min,沉淀用0.5 mol冰醋酸50 ml溶解,同样条件下离心30 min,上清液装入透析袋中,置于0.5 mol 1 000 ml冰醋酸溶液中透析,并持续搅拌透析液,每8 h更换透析液1次,共透析24 h。收获约60 ml胶原溶液,向溶液中缓慢加入2.4 g NaCl,边加入边搅拌,加入过程中有白色絮状沉淀产生。2℃ 20 000 r/min离心45 min,收集沉淀冻干,称重。

  1.3.2  增强酶解法
   
  5 g骨基质粉浸在100 ml 0.1mol M NaOH溶液中间断摇振2 d,中间置4℃冰箱保存。混合物4 000 r/min离心20 min,沉淀反复三蒸水洗涤,浸入含4mol GUHCL的100 ml 5 mmol Tris-Hcl中,处理24 h。再次离心,沉淀反复洗涤后加入200 ml 0.5 mol冰醋酸和250 mg胃蛋白酶,20~25℃持续搅拌72 h。消化后的混合物为无色、透明、黏稠液体。在10 000 r/min 5℃离心20 min,上清缓慢加入NaCl晶体,加入过程中不断搅拌,有大量沉淀产生。再次同样条件下离心,取沉淀加入200 ml 0.5 mol冰醋酸溶液,并装入透析袋中,置于20 mmol Na2HPO4中透析,灭活胃蛋白酶。透析袋中混合物变成乳白色凝块后将透析袋移置0.175 mol醋酸透析液中继续透析48 h,每8 h更换透析液1次,最终收获无色、透明、黏性液体约210 ml,冻干,称重。

  1.4  增强酶解法产物鉴定

  1.4.1  将冻干胶原溶于0.5 m冰醋酸中制成1%(w/v)胶原凝胶液,经稀释后应用Beckman公司的6 300黄金系统高效氨基酸分析仪进行氨基酸分析。

  1.4.2  用SDS-PAGE电泳法检测胶原分子质量及其分布。

  1.4.3  配制0.03%(w/v)胶原凝胶液,装入比色用UV751GD紫外/可见分光光度计测定胶原最大光吸收波长。

  1.5  两提取方法的比较

  1.5.1  将两法所得胶原凝胶液分别装入烧杯中冻干,得到纯化的冻干骨胶原。观察两胶原的色泽、质地及在空气中的吸潮性。

  1.5.2  将两法多次提取的胶原凝胶液分别装入烧杯中冻干并称重。根据胶原提取率=冻干胶原的重量/脱钙骨粉的重量×100%,计算并比较两法胶原的提取率。

  1.5.3  将两法所提胶原的醋酸溶液稀释至0.03%(w/v)后,通过FASCO-3010B型全自动血液流变快测仪测定胶原凝胶液在37℃时的黏度。

  1.5.4  将两法所得胶原制成0.5%的胶原醋酸溶液,调整pH值至中性条件(7.35~7.45),然后迅速加入到六孔板中,置37℃水浴中孵育,观察凝胶形成时间及凝胶性状。

  2  结果

  2.1  鉴定结果

  2.1.1  增强酶解法所提骨胶原氨基酸分析证明骨胶原溶液中各种氨基酸浓度及所占百分比与I型胶原相符。其中,甘氨酸占35.59%,脯氨酸和羟脯氨酸占27.5%。

  2.1.2  最大光吸收波长测定  提取骨胶原蛋白的最大光吸收波长平均值为232.18 nm(表1)。

  表1  骨Ⅰ型胶原的最大光吸收波长(略)

  2.1.3  胶原蛋白电泳及相对分子质量测定  胶原蛋白电泳后可见5个比较明显的条带,根据条带迁移距离由远至近分别代表:α2、α1、α2α1、α1α1和最后的低聚体。条带灰度不一致,表明各成分所占比例不同(图1)。根据蛋白质迁移率与其分子量的对数成反比的特点,先用标准蛋白作图得标准曲线,再根据胶原蛋白各条带的迁移率在标准曲线中找出共对应的值,该值为胶原蛋白某成分的分子量的对数,相应求出该分子量由低到高分别是:79433、91201、169824、184077、260016(表2)。

  表2  胶原迁移距离及胶原分子量(略)

  图1  骨胶原蛋白电泳(略)

  2.2  两种方法及产物比较结果

  2.2.1  大体观察  增强酶解法所提骨胶原冻干后呈蓬松海绵状,纯度较高,颜色洁白(图2),具强烈吸潮性,置于空气中吸收水分会增加重量。碱溶法所得胶原质地相对较密,颜色发黄(图3)在空气中放置亦发生吸潮现象。

  图2  冻干骨胶原(酶提法)(略) 

  图3  冻干骨胶原(碱提法)(略)

  2.2.2  提取率计算  两法各分5批次提取骨胶原,增强酶解法胶原提取率为(94.04±0.55)%(表3)。碱溶法胶原提取率为(57.8±4.96)%(表4)。

  表3  增强酶解法骨胶原提取法(略)

  表4  碱溶法骨胶原提取率(略)

  2.2.3  黏度测定  增强酶解法和碱提法所提骨胶原醋酸溶液均为黏性液体,浓度稀释到0.03%后,在温度37℃条件下测得的胶原凝胶液黏度分别为3.71和2.81。

  2.2.4  凝胶固化试验  在pH值7.35~7.45、温度37.0℃条件下,增强酶解法所提胶原凝胶液约10 min可固化形成凝胶块,碱提法所提胶原仍为黏性液体(图4)。所形成的凝胶块透明,有一定机械强度,可随意切割成不同形状(图5)。

  图4  未固化的胶原液体(左)和骨胶原凝块(右) (略)

  图5  切割后的凝胶块(略)

  3  讨论
   
  I型胶原蛋白作为哺乳动物的主要结构蛋白具有抗原性低、可降解吸收、能迅速止血并促进细胞生长等功能,近年来在制药、基础研究、临床治疗等方面应用日益广泛[1,2]。骨中有机质90%以上为胶原蛋白,且主要为I型胶原蛋白,有望成为制备I型胶原的主要来源。但常用的碱溶法提取骨胶原,存在产量低、纯度低、所提胶原成胶性差等不足。增强酶解法是本实验室在传统酶解技术提取胶原的基础上,先以NaOH去除脱钙骨基质中的特异性非胶原蛋白成分,再用盐酸胍降低分子间非离子键的作用,最后用胃蛋白酶去除胶原的端肽,使不溶性胶原变为以单体为主的可溶性胶原,再经过盐析、透析纯化等处理而获得I型胶原的方法。利用该方法提取的皮质骨胶原氨基酸分析证实符合I型骨胶原氨基酸组成,其中甘氨酸(35.59%)、脯氨酸和羟脯氨酸(27.5%)的高比例含量也支持I型胶原组成特点[3]。色氨酸的吲哚环是蛋白光吸收性能的主要结构,胶原中不含有色氨酸,因此胶原蛋白的最大光吸收波长不是一般蛋白质的280 nm而是230 nm。本实验提取的胶原最大光吸收波长为232 nm,亦符合胶原蛋白的此特征。胶原分子由3条α链组成:2条α1链和1条α2链,即:[α1]2[α2],中间为螺旋区,两端为非螺旋区。增强酶解法提取胶原蛋白电泳所得5个条带分别代表了骨胶原蛋白经胃蛋白酶处理由不溶性变为可溶性后的主要组成成分。α2链为轻链分子量为79 000,电泳后其迁移距离最大,在所有条带的最前端,α1链为第2条带,其分子量大于α2链,约为91 000。骨胶原存在螺旋区与螺旋区之间的交联,胃蛋白酶对此类交联难以发挥作用,因此骨胶原凝胶液中存在一定量的由多个肽链聚积在一起的低聚体,形成了电泳凝胶中的第5条带,分子量超过260 000。
   
  与碱提法相比较,增强酶解法处理过程中,所用胃蛋白酶去除了胶原的端肽,使不溶性胶原变为以单体为主的可溶性胶原,因而获得了较高的提取率。两组各5批次提取产量经统计学处理后提示增强酶解法的提取率明显高于碱提法。胶原材料力学支撑性能欠佳,在负荷条件下难以维持结构完整,因此限制了其单独作为支架材料的应用[4]。本试验两法所得胶原均为蓬松海绵状,缺乏力学抵抗力。不同的是酶解法所提胶原颜色洁白,碱提法所得的胶原,颜色发黄,且密度稍高。考虑是碱提法工艺相对粗糙,所得胶原杂质含量较高所致。
   
  胶原中性、37℃条件下迅速形成凝胶,将种子细胞黏附在支架材料上的特性可明显增加组织工程骨构建过程中种子细胞的上架率[5],而且胶原凝胶所提供的生长环境符合MSCs的生存需要,可使其在短时间内恢复活性状态,从而利于后继的成骨过程[6]。本试验将两种方法所得胶原进行了中性、37℃条件下凝胶固化实验的测试。碱提法所得胶原溶液在pH3~4时出现凝胶块,pH增加到5左右时凝胶溶解,变回了透明的黏性液体,在中性条件时,37℃孵箱中孵育半小时无固化表现。增强酶解法所得胶原溶液pH值调为中性后,37℃孵箱中约10 min左右固化为一定机械强度的乳白色凝胶块。虽然碱提法所得的胶原溶液亦可固化形成凝胶,但固化时pH3~4的条件不适合细胞生长,因此不能应用于组织构建。而增强酶解法所提胶原中性、37℃条件下具有良好成胶性,适于工程化组织的构建。
       
  综上所述,增强酶解法可从皮质骨中提取I型胶原,且该法比碱提法可获得更高的提取率。所提取的I型胶原纯度高,黏度高,凝胶固化性好,可应用于工程化组织的构建过程。

【参考文献】
    [1] Go′mez-Guille′n B,Gime′nez PM.Extraction of gelatin from fish skins by high pressure treatment[J].Food Hydroclloids,2005(19):923-928.

  [2] 刘慧玲,王 栋,章金刚.胶原蛋白在临床医学中的应用[J].北京生物医学工程,2005,24(3):239-241.

  [3] 叶易春,但卫华,曾睿,等.酶法提取牛腱胶原的研究[J].中国皮革,2005,34(7):4-7.

  [4] 卢华定,蔡道章,吴 刚等.Ⅰ型胶原半月板支架负载纤维软骨细胞体外培养[J].中国矫形外科杂志,2005,13(16):1252-1255.

  [5] 吕仁发,周 强,许建中,等.双相接种法体外构建组织工程骨[J].第三军医大学学报,2005,27(16):1656-1659.

  [6] 杨志明,余希杰,黄富国,等.外源性I型胶原对人胚胎骨膜成骨细胞生物学特性的影响[J].华西医大学报,2001,32(1):1-4.


作者单位:第三军医大学西南医院骨科,重庆市 400038

作者: 施洪臣,吕仁发,周强,许建中 2008-5-30
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