同种异体骨移植的基础研究与临床应用

【关键词】  同种异体骨移植的基础研究与临床

　　各种原因造成大段骨、关节缺损的修复是修复重建外科领域较为普遍而又棘手的问题。同种异体骨来源丰富，不受形态、大小限制，且具有生物活性，临床广泛应用日益增多，已取得了较成熟的经验。笔者就同种异体骨移植的研究进展作综述如下：
   
　　1  同种异体骨采集来源
       
　　临床异体骨常取自：(1)截肢的骨组织；(2)胸部手术中切除的肋骨；(3)新鲜尸体骨骼，包括死婴(多采用软骨)。禁忌采集来源于肿瘤、传染病、细菌性感染、骨病、血液病患者的骨组织。对于新鲜尸体，应争取在死后6～12 h内的无菌状态下取骨，并经相应的处理后存入骨库。
   
　　2  同种异体骨的保存
       
　　同种异体骨的保存方法很多，但临床应用效果肯定、国内外骨库应用最多的是深冻法和冻干法。

　　2.1  深冻法
   
　　将获得的同种异体骨表面软组织、骨膜和骨端软骨彻底剔除，根据需要制成不同形状、大小的移植骨材料，使用无菌盐水或抗生素盐水进行加压冲洗尽量去除骨髓组织，然后进行无菌包装，采用逐渐降温法，先将移植骨放人-4℃的冷库中，12h后再逐渐降至-80℃保存。Friedlaender和Bumhardt等研究发现异体冷冻骨移植后仅能引起强度很弱的慢性免疫排斥反应，通过冷冻使异体骨的免疫原性大大降低。Poitout［1］认为，深冻骨抗原性和移植后的生物学特性明显优于新鲜异体骨组织，取得较为满意修复效果。深低温(-80℃)状态下，酶的活性基本消失，酶对骨的破坏最小，胶原酶处于静止状态保存期可长达数年［2］。深冻法适用于各种骨移植材料保存，是要求保留软骨活性的同种异体骨、关节保存的首选方法。

　　2.2  冻干法
       
　　将新制成的深冻骨放入干燥机内，使骨组织内剩余水分降低到5％以下，然后进行无菌包装，置于无菌真空容器中常温保存。冻干法有常温保存、便于运输的特点，常用于制备松质骨条、骨块、骨钉和需要常温运送保存的大段骨，但它对骨强度有明显影响，对大段的和需要承重的移植骨，应该尽量避免应用冻干法保存。
   
　　3  同种异体骨的灭菌
       
　　灭菌是制备同种异体骨的重要环节，目前国内外骨库大多用环氧乙烷和γ射线灭菌。

　　3.1  环氧乙烷(EO)灭菌
       
　　EO通过使微生物中的核酸烷基化和酶的灭活而发挥灭菌作用。一般用于同种异体骨灭菌的EO浓度为450～1 500 ms／L，温度为20～60℃，有效湿度为30％～60％，经过2～5 h时薰蒸可杀灭各种细菌、芽胞、病毒。EO消毒对移植骨的生物学性能有一定损害作用。Thoren等认为，大剂量EO气体会影响未脱钙骨的骨传导，使骨传导小室中的骨生长速度降低大约一半。Aspenberg等发现EO对骨诱导的影响存在剂量依赖关系，大剂量影响骨诱导活性。另外，EO对致密的皮质骨仅能穿透6 mm，目前仅推荐用于颗粒状骨材料的消毒。

　　3.2  照射灭菌
   
　　60Co γ射线辐照通过激发电子的直接作用和促进·H和·OH自由基生成的间接作用，使微生物中的蛋白、酶、核酸及DNA灭活而起到灭菌作用。推荐使用的辐照有效剂量为15～25 kGy。25 kGy的γ射线辐照不影响移植骨力学强度，并保留部分骨诱导能力，无明显的临床危害作用［3］。γ射线辐照适用于各种骨移植材料消毒、灭菌，大多数组织库常使用该灭菌方法。

　　4  同种异体骨移植后的愈合

　　4.1  同种异体骨移植后的愈合机制

　　4.1.1  自身成骨作用  新鲜同种异体骨移植，存活的细胞具有早期成骨能力，但因免疫反应，供体来源的细胞被杀死，早期成骨亦被吸收，所以这种成骨作用是无效的。库存骨的细胞成分多已死亡，不具备自身成骨能力。

　　4.1.2  骨传导作用  骨传导作用也就是支架作用，是移植骨周围组织床的血管、骨祖细胞沿植入物的机械引导侵入其内部，实现爬行替代的过程。骨传导作用仅见于移植物植入骨骼系统内，无活性的植入物植入骨骼系统以外仅能引起纤维组织替代，形成疤痕组织［4］。同种异体移植骨的愈合、替代过程主要依靠骨的传导作用。

　　4.1.3  骨诱导作用  骨诱导作用是指来自植床周边宿主结缔组织中的可诱导成骨前体细胞即间充质细胞，在诱导因子的作用下可被诱导成骨原细胞，经成骨细胞形成新骨，这种成骨方式是间接的，称为骨诱导，骨诱导在异体骨愈合早期发挥重要作用［5］。Urist等自骨基质中提取出骨诱导物质，称为骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，BMP能诱导结缔组织中的间质细胞、骨髓基质细胞、滑膜细胞、成纤维细胞呈现为软骨细胞和骨细胞表型，即诱导上述细胞在骨骼或骨骼以外的部位产生软骨和骨组织，这就是骨诱导成骨理论的核心。

　　4.2  同种异体骨移植后的愈合方式
   
　　同种异体骨移植愈合过程是移植骨再血管化、新骨形成、宿主骨床与移植物连结而实现骨掺入的过程。Burchardt［6］将同种异体移植骨与宿主的愈合方式分为3型。I型：愈合过程与自体骨移植相似，没有疲劳骨折。移植16周后同种异体移植骨与宿主骨连接，移植骨的成骨量、塑形均与自体移植骨接近。Ⅱ型：愈合过程缓慢，表现为：(1)较多发生骨不连接或延迟连接；(2)移植骨周边被吸收或移植骨体积变小；(3)移植骨内部被吸收范围扩大，延伸至间质板层；(4)移植骨机械强度明显下降。Ⅲ型：没有修复征象，移植骨迅速地被吸收，骨不连接。在低温保存的骨库异体骨愈合过程中，各型愈合方式所占的比例约为：Ⅰ型占20％，Ⅱ型占60％，Ⅲ型占20％。同种异体骨移植的愈合过程与自体骨移植的不同之处主要表现为同种异体移植骨的成骨与血管长入的速度和程度都不及自体骨，且同种异体移植骨相对自体移植骨更易被宿主吸收。
   
　　5  异体骨的免疫原性及处理方法

　　5.1  同种异体骨移植免疫排斥基础
       
　　异体组织排斥反应是由供体主要组织相容性复合体(MHC)抗原引起的宿主对异体基因供体组织的免疫攻击。同种异体骨抗原物质主要存在于骨髓的造血细胞、血管内皮细胞、树突细胞、巨噬细胞和骨细胞［7］。细胞膜表面糖蛋白是其抗原的主要成分，它们受MHC基因的控制，在人类为人白细胞抗原(HLA)基因。同种异体骨移植引起的免疫反应是通过T细胞介导的细胞免疫。孙磊等试验表明，免疫反应可抑制BMP的诱导成骨作用［8］。库存的同种异体骨几乎无活性细胞，其细胞的MHC抗原片段由宿主抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)摄取、加工、处理，通过间接途径呈递给宿主T细胞，激起免疫应答，导致慢性排斥反应或免疫耐受状态［9］。另外，库存同种异体骨移植后必须通过再生血管宿主APC才能深入到坚实的供体骨基质内部，与供体MHC抗原相接触［10］，因此，免疫排斥反应出现较晚且程度较轻。

　　5.2  降低同种异体骨移植免疫排斥的方法

　　5.2.1  对移植骨抗原的处理  尽量去除或杀死移植骨内的细胞成分，以减弱其抗原性。彻底刮除移植骨的骨髓、骨膜，反复洗涤，是简单有效的去除抗原方法，但机械方法不可能完全去除移植骨的细胞成分。目前常采用低温冷冻、冻干和脱钙脱脂、电离辐射等技术对异体骨进行处理以进一步减弱其免疫性。

　　5.2.2  植骨供体和受体的组织配型  为了减弱异体骨的免疫排斥，人们曾试图如器官移植样进行MHC组织配型。Stevenson等［11］对组织相容和不相容组小猎犬进行桡骨移植，结果显示组织不相容的异体深冻骨的活骨面积和新骨在沉积优于新鲜骨，但都低于相容供体同种骨与自体骨。Leunig等［10］在小鼠同种异体骨移植中，量化测定移植骨的血管生长和新骨形成，结果发现移植骨的整合和排斥反应是受微血管系统调节的，MHC不匹配加速同种异体骨的排斥反应。
       
　　人类同种骨移植组织配型的效果与动物实验的结果是否相同受到关注。目前一般认为组织配型会改善MHC不匹配新鲜移植物愈合行为，但是对冷冻移植物则效果不确定［12］，因此，临床上常规尚不对同种异体骨移植进行组织配型。

　　5.2.3  免疫抑制剂的应用  Shigetomi等［13］观察到长期应用环孢菌素A(CsA)的带血管的大鼠同种异体骨移植的愈合与不用CsA的带血管自体骨的愈合相同。Shigetomi等也证实，应用免疫抑制剂环孢菌素(CsA)能明显改善移植骨的生物学行为，获得较好效果。也有研究指出，移植后免疫抑制剂的应用能导致移植骨的吸收增加，同时可产生诸多并发症，如伤口愈合差、感染、体重减轻、白细胞计数减少等。因此，临床行低温骨库保存的同种异体骨移植时，一般不使用免疫抑制剂。
   
　　6  同种异体骨移植临床应用
       
　　同种异体骨移植材料及手术方式的选择应根据移植目的决定。单纯的骨腔填塞可选用皮松质骨粒。涉及负重及其他力学性能的植骨应选用相对应的异体骨段行嵌入植骨，同时给予坚强的内固定。若植骨长度较大，可同时复合带红骨髓的自体骨移植，以增加其成骨能力，促进植骨愈合。关节融合术中植骨也应实施复合移植，自体、异体骨同时应用。多项研究证实，复合移植预后优于单纯异体植骨。
   
　　7  同种异体骨移植的并发症及对策

　　7.1  感染及对策
       
　　术后晚期深部感染成为同种异体骨移植最主要的并发症。预防措施有：移植骨严格消毒；严格无菌操作；移植骨周边应有良好的软组织覆盖，甚至可以行肌瓣转移或移植；预防性使用抗生素；充分引流渗出物。

　　7.2  移植骨延迟愈合、不愈合、疲劳骨折及对策
       
　　同种异体骨移植后骨延迟愈合、不愈合，疲劳骨折较自体骨移植发生率高。为了促进愈合，防止骨折，在不影响肿瘤切除情况下，应尽可能保护宿主骨局部的血运及周围软组织；在不影响生物力学的前提下增加移植骨与宿主骨的有效接触面积；在不影响愈合的情况下给予坚强的内固定加适当的外固定；采用复合自体骨膜或松质骨移植等方式。还应该注意预防疲劳骨折，在移植骨没有被完全替代时，应避免反复应力作用。

　　7.3  创伤性关节炎、关节功能障碍及对策
       
　　异体骨关节移植后，如何尽快、尽可能大面积地建立活性有效的关节面，是骨关节移植的重要课题。利用关节软骨移植或把BMP及各种生长因子，如肝细胞生长因子(HGF)注入关节腔内来促进移植骨关节功能恢复的课题正在研究当中［14］。
　　
　　8  小结
       
　　随着骨保存技术的发展，同种异体骨的处理与保存方法日趋完善，各种方法处理的同种异体骨具有免疫原性低、安全有效的特点，已广泛用于临床。复合骨髓、自体骨的同种异体骨移植方法的出现，提高了术后的临床治疗效果。此外，为了提高移植骨的诱导成骨活性，近年来人基因重组BMP(rhBMP)应用受到重视，复合BMP的同种异体骨材料有利于新骨形成［15］，加速爬行替代，减少骨折、不愈合、植入骨的吸收及关节塌陷等并发症，现己应用于临床［16］，取得良好疗效。相信随着对同种异体骨免疫原性及诱导活性的不断深入研究，移植骨和宿主骨交界处细胞和分子水平相互作用机制研究的加强，同种异体骨必将会有更为广阔的应用前景。
   

【参考文献】
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作者单位：潍坊医学院整形外科研究所， 潍坊 261042；解放军第89医院创伤骨科研究所，潍坊 261042