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【关键词】 制备高诱导成骨活性的脱钙骨基质
1 前言
骨缺损一直都是困扰骨科医师的一大难题。人们对其的关注和研究由来已久。几个世纪以来，人们尝试了众多不同的修复方法并公认自体骨移植是治疗骨缺损的有效方法。但是，自体骨的数量有限且患者还须经受另一次的额外手术打击，就整体而言，有其难以克服的一些缺点。因此，广大医师及科研工作者长期致力于寻找一种合适的材料来替代自体骨。
2 脱钙骨基质概述
2.1 历史沿革
在人们意识到自体骨移植的种种缺点后，就不断地探索将新材料用于修复骨缺损。1965年，Urist〔1〕首次明确提出了脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）具有成骨诱导能力。Urist的这一研究具有里程碑式的意义，它使脱钙骨基质的研究在理论和临床两个方面都获得了长足而广泛的进展。1979年，Urist在兔骨中提纯出BMP，明确提出BMP学说〔2〕，使脱钙骨基质的骨诱导理论更加学说化。经过Urist和其他一大批人的努力，不仅认识到脱钙骨基质成骨诱导活性的关键因子——骨形态发生蛋白（bone moephogenetic protein,BMP）是广泛存在于骨基质中的一种无种属特异性的，属局部生长因子的酸性糖蛋白，而且认识到，离开载体存在的外源性骨基质，包括BMP等生长因子极易被降解、吸收以至于起不到应有的效果。而脱钙骨本身就是一种良好的载体，这进一步奠定了DBM在修复骨损伤中的地位，并为人们制备DBM与其他因子的复合物提供了理论基础。
2.2 成骨机理
大多数学者较为一致的看法是：由于脱钙骨基质中含有骨形态发生蛋白（BMP）及其他多种成骨因子，它们与骨基质内的胶原紧密结合，可诱导间充质细胞分化为软骨细胞及成骨细胞，最终形成软骨组织和骨组织，所以，脱钙骨基质具有较强的诱导成骨能力。另外，脱钙骨基质所具有的天然孔隙结构，也有利于骨活性物质和细胞因子长入，从而更好地发挥骨传导作用，促进骨的形成。
新鲜同种异体骨或异种骨移植会引发较强烈的免疫排斥反应，这也是影响成骨并导致移植失败的一个重要原因。通过研究，人们普遍认为细胞成分是骨的主要抗原来源；而脱钙骨基质制作过程中的脱钙脱水脱脂等流程就能破坏细胞，也进一步破坏了骨组织部分免疫原性。另一方面，孙磊等〔3〕研究认为：免疫排斥抑制移植物成骨，而骨诱导活性物质抑制免疫排斥反应，免疫排斥反应与骨诱导活性呈负相关。这样，经脱钙、降抗原处理并含有相当含量骨诱导活性物质的脱钙骨基质就有了良好的生物相容性。丛锐等人〔4〕也通过毒性实验和溶血实验、凝血实验、皮内实验、热源实验、肌肉内植入实验和血清特异性抗体检测，证实以脱钙骨基质为主要成分的骨移植材料是一种无毒、无刺激，不含热源和不引起免疫排斥反应的生物材料。
2.3 DBM成骨活性的检测
DBM成骨活性的检测主要有体内评价和体外评价法〔5〕。体内评价指将DBM植入动物体内，观察成骨情况，从而对DBM骨诱导进行定性或半定量检测。Urist将同种异体脱钙骨植入兔、大鼠、小鼠的腹直肌、股四头肌、竖脊肌中，通过影像学和组织学评价成骨情况。
体外评价指在体外将特定的组织细胞与DBM同时孵育，通过生物检测间接评价DBM的骨诱导活性。Zhang等〔6〕采用体外ALP（碱性磷酸酶）的活性检测方法测定人DBM的骨诱导活性。将人骨膜细胞HPO置于含DBM的培养液中培养并检测融合后细胞的ALP活性。Adkisson〔7〕用Saos2骨肉瘤细胞的增殖率衡量DBM的骨诱导性，也提示Saos2细胞增殖可以作为测量DBM骨诱导活性的间接方法。
一般认为，体外评价方法简单快捷，检测条件较体内评价方法易于控制，在实验与临床上都可用于对DBM骨诱导活性的检测，是DBM活性检测和评价的主要方法。
3 DBM制备方法
3.1 改良Urist法
DBM的制备最初是由Urist提出的〔8〕，之后，又被Reddi和Huggins〔9〕改良，这就是作者今天所常用的改良Urist方法：（1）无水乙醇脱水2 h；（2）乙醚脱脂1 h，风干0.5 h；（3）蒸馏水冲洗3次；（4）0.5 mol／L盐酸脱钙；（5）蒸馏水多次冲洗至pH为7.0左右为止；（6）无水乙醇脱水2 h；（7）乙醚脱脂1 h；（8）通风橱内通风过夜干燥；（9）得到脱钙骨基质颗粒（DBM）；（10）60Coγ射线辐射消毒。
3.2 其他细节
关于脱脂的方法，用得比较多的有乙醚脱脂和1∶1氯仿／甲醇脱脂，但也有很多研究单位用超声脱脂法。
在脱钙的环节上，有使用盐酸脱钙的，亦有使用混合的甲酸和柠檬酸、乙酸脱钙，在较为常用的盐酸脱钙中，有以下几种不同的方法：（1）0.6 mol／L盐酸脱钙4～5 h；（2）0.5 mol／L盐酸按50 ml／g骨块比例，15 ℃下脱钙72 h〔10〕；（3）0.5 mol／L盐酸脱钙3 h〔11〕。
其他制备细节上的区别主要在消毒方法上，归纳起来不外于两种：γ射线消毒和环氯乙烷消毒。
关于DBM制备，还有一些需要引起足够的重视，那就是由于供体骨来自不同的供体，它们的骨诱导活性不尽相同，同时，出于安全性的考虑，应当注意一个批次的DBM制品要来自同一个供体。
4 影响DBM诱导成骨活性的几点因素
有实验发现不同厂商不同方法制备的DBM，甚至是不同形状的DBM诱导成骨活性有一定的差异〔12〕，这就促使人们思考影响DBM活性的因素，并加以研究：
4.1 年龄对DBM诱导成骨活性的影响
一般认为，随供者年龄的增长，DBM的诱导成骨活性会呈降低趋势。然而，Pinholt等〔13〕以大鼠作为实验对象研究了供者年龄与其诱导成骨活性的关系。实验结果显示，从幼年到成年，其DBM的诱导成骨活性随年龄的增长而增长，但在老年后，其DBM的诱导成骨活性随年龄而逐渐下降。Pinholt认为出现这一结果可能与DBM所含的如BMP等生长因子的水平有关。综上，可以这样认为，从出生到成年，随供者年龄增长，DBM的诱导成骨活性逐渐增强，在到达一个顶峰后，随着供者进入老年，DBM的诱导成骨活性逐渐下降。
年龄对DBM的诱导成骨活性影响的基本规律已经被人们认识，但是将来在诸如最佳供者年龄段这样的具体细节上的研究，也许会使DBM制品的效能产生意想不到的提高。
4.2 DBM颗粒大小对诱导成骨活性的影响
1979年，Syftestad等证明诱导成骨活性的强弱与DBM的颗粒大小有关。Sampath等将重组DBM粗颗粒（74420 um）及细颗粒（4474 um）分别植入鼠体内测定诱导成骨活性，结果显示重组后的粗颗粒组的诱导成骨活性远大于细颗粒组，从而说明DBM的几何形状在发挥其效能上的重要作用。其他一些研究团体也进行了这方面的一些探索，并在自己的实验和临床中应用了不同规格的颗粒，取得了一些效果。如74～420 μm大小颗粒〔10〕，200～700 μm大小颗粒〔14〕，1 mm大小颗粒以及2.5 mm大小颗粒等。
目前看来，虽然DBM颗粒大小影响诱导成骨活性已成共识，但对于何种颗粒是最理想选择，尤其是人DBM在人体内，多大规格的颗粒是较佳选择，还需要进一步的摸索。
4.3 DBM表面结构对诱导成骨活性的影响
在治疗掌指骨缺损的实践中，已有将DBM制品用于临床的尝试。但钱鏊〔15〕的研究表明，对于短管状的皮质骨DBM制品，表面经处理形成纳米级沟槽的DBM效能要好于未经这样处理的DBM。这也给作者进一步提高DBM的效能提供了新的启迪。
4.4 脱钙对DBM的诱导成骨活性的影响
4.4.1 脱钙剂型
曾经有人使用混合的甲酸和柠檬酸、乙酸脱钙，但更常用的脱钙剂是盐酸，而且研究认为，以盐酸脱钙成骨活性率最高〔5〕。
4.4.2 脱钙程度
DBM诱导成骨的能力主要依赖于其中的骨形态发生蛋白（BMP）及其他生长因子的协同作用。但是在正常完整的骨中，BMP被致密的矿物成分所包绕隔离，难以有效发挥诱导成骨功能。脱钙后，一方面解除了对BMP的包绕，使其能够顺利释放从而发挥诱导成骨作用，另一方面脱钙骨基质特有的多孔隙结构，确保BMP可以持久稳定地缓慢释放，使BMP能够长期发挥作用，而且这种多孔隙结构也适宜新骨生长替代，所以脱钙就成为了决定DBM效能的主要一环。
Urist等人早期曾认为部分脱钙骨诱导能力低下，而接近或完全脱钙的DBM则呈现较高的诱导成骨活性。以此为依据，一些研究团体在脱钙步骤中基本是完全脱钙，得到较为彻底的脱钙骨基质〔10〕。
但是，也有人认为DBM中保留适当含量的Ca2+可以作为新生骨再钙化的核心，为磷酸钙的沉积提供晶核。有的研究显示过度洗涤胶原将完全抑制矿物质在胶原上的沉积，而胶原内再加入磷酸盐可恢复其矿化能力，说明固态磷酸盐可能是一个潜在的矿化核心。这就提示，主要成分为胶原的DBM可能同样需要少量的固态磷酸钙来增强其诱导成骨活性。有人也提出，在完全脱脂脱水，95%～98％的脱钙率，pH不小于7.0时，骨形态发生蛋白（BMP）具有良好的活性〔17〕。这就进一步为DBM制备中合适的脱钙程度提供了参考。
4.5 消毒方式对DBM诱导成骨活性的影响。
Urist早期曾使用0.6 mol／L HCl浸泡1 h后再用70％乙醇来作消毒处理，并取得成功，但鉴于这种技术对于粉状或胶状DBM制剂操作复杂，现在已经很少使用。
环氧乙烷（EO）消毒在临床已有广泛的应用，这种方法设备简单易得，操作便利快捷，但是缺点也是明显的，首先是EO可以破坏脱钙骨的诱导成骨能力。EO使用剂量较小不足以杀死细菌芽胞，使用剂量过大，则脱钙骨的诱导成骨活性大大降低〔18〕。但也有研究〔19〕认为，纯化的诱导成骨蛋白对EO的破坏有抗拒作用，从而使EO对诱导成骨活性的不良影响降至可容忍的水平。其次，由于EO具有致痛性，所以DBM在应用EO消毒后植入前需彻底除去残留的EO。总之，只要选择合适的使用对象，严格控制残留的量，EO消毒以其特有的优点，也还是有相应的使用空间的。
同种骨的辐照灭菌在上世纪50年代就有了应用，被证明是一种稳定有效的灭菌手段。然而它同样存在对DBM诱导成骨有影响的问题。Urist等根据大鼠脱钙骨肌内埋入实验指出，40～50 kGy辐照可使新骨生成减少90％～100％，并认为这是BMP遭到破坏的结果。事实上在一定条件下，照射剂量超过25 kGy时，DBM的诱导成骨活性就已经开始减弱〔20〕。不过，也有人的研究结果与上面的观点不尽一致，Wientroub等〔21〕报告10～50 kGy照射对碱性磷酸酶水平和新骨形成，并不影响，30～50 kGy甚至有所增加。但是也承认超过50 kGy时，诱导成骨活性显著降低。当然，消毒所需要剂量也不是绝对的，因为，灭菌保证水平（SAL）取决于初始菌量。如果制备中严格控制初始菌量，消毒所需剂量也就可以相应减少了〔18〕。近年来，针对γ射线照射灭菌，人们做了大量的研究，虽然得出的结论各不相同，甚至差别很大，但是，综合考虑灭菌水平、安全有效、生物活性等因素，γ射线照射灭菌正被越来越多的人所接受。
5 临床应用
DBM自问世以来就在临床上获得了较快推广，使用DBM替代自体骨在外科手术中，对于填充骨缺损，实现正常的解剖关系，恢复功能，桥接缝隙等都表现出了很好的疗效。作为一种温和的具有诱导成骨活性的材料，DBM广泛应用于脊柱融合手术中刺激横跨椎骨间的新骨质生成〔22〕，骨肿瘤术后修复和疗效巩固〔23〕以及股骨头坏死重建等〔24〕。
近来，鉴于DBM本身富有胶原和诱导成骨活性较强的特点，也被尝试用于软骨缺损的修复，并展现了良好的前景。〔25〕
但是DBM在人和其他大型高等动物身上表现出的疗效确实比不上在低等动物实验中所表现的那么明显。所以，人们现在转而研制重组的BMP产品：包括经过强化BMP的DBM以及DBM和自体骨髓的复合物等。现在看来，重组的DBM复合物总体上效果要好于单纯的DBM。
6 总结
脱钙骨基质（DBM）由于它的低抗原、能被新骨替代、尤其是诱导成骨活性等特点，自上世纪80、90年代以来，就成为人们关注的热点。制备合格高效的DBM自然也成为人们探索的重点，以至于DBM的制备方法也不断被改良。随着对DBM认识的不断深入，进一步研究影响DBM诱导成骨活性的一些因素，以期在将来的制备过程中，权衡利弊，合理选择，修订出一个更加科学的制备流程。现今，为了提高效能，拓宽使用范围，多种规格各种性状的DBM复合制品也获得了较快发展。但是，尽管人们对DBM的研究已持续了30年，它依然有许多的问题等待人们去解决，制约诱导成骨活性因素的深入研究，以及多因子与DBM复合应用的方法，剂型的进一步论证开发，有可能成为今后骨移植研究的重要方向。
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作者单位：解放军总医院第一附属医院骨科，北京 100037