重组人红细胞生成素治疗脊髓冲击性损伤的实验研究

【摘要】  ［目的］研究重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)对脊髓冲击性损伤的治疗效果。［方法］24只新西兰白兔采用重物坠落的方法造成脊髓冲击性损伤。损伤12 h后，对照组静脉给予生理盐水；小剂量组、中等剂量组和大剂量组分别静脉给予rhEPO 100、500、1000 IU／kg。损伤后24 h、48 h、1周评估下肢神经功能。损伤后1周时处死动物，脊髓标本进行HE和Caspase3组化染色，电子显微镜评估超微结构损伤。［结果］EPO治疗组的神经功能评分明显高于对照组，HE染色和电子显微镜显示组织和超微结构损伤明显轻于对照组，Caspase3阳性细胞数明显少于对照组。中等剂量组和大剂量组的治疗效果无显著性差异。［结论］脊髓冲击性损伤后12 h给予人红细胞生成素可减轻脊髓的组织和超微结构继发性损伤，并可对抗神经细胞凋亡，促进脊髓功能恢复。中等剂量EPO是治疗脊髓损伤的适当选择。

【关键词】  重组人红细胞生成素； 脊髓损伤； 凋亡； 超微结构

　　脊髓损伤从受伤至经检查明确诊断及开始治疗，一般需数小时甚至更长时间。除手术解除脊髓压迫外，大剂量甲基强的松龙冲击是被广泛应用的药物治疗方法，但功能恢复令人失望，同时大剂量甲基强的松龙的副作用也不能忽视［1］，探索脊髓损伤新的药物治疗方法是迫切需要解决的问题。已证实红细胞生成素是一种具有神经营养和保护作用的细胞因子，脊髓损伤后即刻给予EPO可减轻脊髓损伤程度［2］，但脊髓损伤后数小时或更长时间后给予EPO的治疗效果及EPO的剂量-效应关系分析尚未见文献报道。本研究观察兔脊髓损伤后12 h给予不同剂量重组人红细胞生成素(rhEPO)的治疗效果。
   
　　1  材料和方法

　　1.1  脊髓损伤方法
   
　　速眠欣(0.2 ml／kg)肌肉注射麻醉，俯卧于实验台上。胸背部正中切开，显露棘突及椎板。切除T8棘突及全椎板，显露硬膜囊。以20 g圆柱状(直径3　mm)重物通过导向套管，于脊髓上方4 cm垂直落下(80 g／cm)，造成脊髓冲击损伤。关闭切口，12 h后静脉给予不同药物治疗。每日行人工挤压排尿3次，直至可自主排尿。

　　1.2  实验设计
   
　　新西兰白兔24只，8～12个月龄，体重2.2～3.2 kg，置于室温、湿度控制的房间内单笼分别饲养。随机分为4组，每组6只。(1)对照组(Control)，脊髓损伤12 h后静脉注射生理盐水2 ml;(2)小剂量EPO组(E100)，脊髓损伤12 h后静脉rhEPO(济脉欣，华北制药金坦科技有限公司，下同)100 IU／kg;(3)中等剂量EPO组(E500)，脊髓损伤后12 h后静脉给予rhEPO 500 IU／kg;(4)大剂量EPO组(E1000)，脊髓损伤12 h后静脉给予rh-EPO 1000 IU／kg。
   
　　麻醉觉醒后及脊髓损伤后24 h、48 h、1周采用Drummond，J．C.& Moore标准［3］评价下肢运动机能。
　　
　　1.3  HE和Caspase3染色及电子显微镜观察
   
　　7 d后大剂量速眠欣(0.5 ml／kg)麻醉试验动物，再次显露并完整取出脊髓损伤节段，长约10 mm。以损伤中心为界，将脊髓横切分成两半，一半脊髓标本进行HE染色和Caspase3染色。另一半行电子显微镜检查，观察超微结构损伤情况。

　　1.3.1  HE染色  10％福尔马林固定72 h，石蜡包埋，制作5 μm的组织切片，常规HE染色，光镜下观察。

　　1.3.2  Caspase3免疫染色  脊髓切片脱腊，以含3％H2Ｏ2甲醇反应5 min。加入1∶400稀释的活性型Caspase3抗体(北京博奥森公司)，在4℃湿润的反应盒内反应一夜晚。以PBS清洗3次，各5 min。滴加Dakocytomation Envision(+)增强剂，37℃下反应1 h。PBS清洗2次，DAB显色。细胞核染成茶色者，判断为活性型Caspase3阳性细胞。选择一侧脊髓前角、后角、后索共3个区域，区域中心确定方法为：中心管和前角顶点连线的中点(黄色方框)、中心管和后角顶点连线的中点(蓝色方框)、灰质背侧表面和脊髓背侧表面最短距离连线中点(红色方框)(图1)。每个区域中心用400倍光学显微镜观察并照像，照片上Caspase3阳性细胞计数3次，取平均值。

　　1.3.3  电镜观察  取脊髓损伤中心1 mm脊髓标本，以2％戊二醇固定2 h，然后以1％锇酸固定，脱水，以Epon 812包埋。制作组织薄片以双氧铀醋酸铅柠檬酸盐染色，用电子显微镜(JEM 100CXⅡ)观察脊髓超微结构损伤，并采用Kaptanoglu［4］评分，评分越高代表脊髓损伤越重。

　　1.4  统计学分析
   
　　使用SPSS 11.0统计学软件包，采用非参数秩和检验，组间比较采用MannWhitney统计，以P<0.05为差异具有显著性。
   
　　2  结果
   
　　麻醉清醒后，各实验组均出现完全性下肢瘫痪症状。脊髓损伤24 h后各组实验动物神经功能开始有所恢复，48 h、1周时神经功能进一步恢复，中等剂量(500IU／Kg)和大剂量(1000 IU／Kg)EPO治疗组神经功能评分明显优于对照组和小剂量组，大剂量治疗组神经功能略优于中等剂量，但两者差异无显著性(图2)。
   
　　1周后的HE染色显示：对照组的脊髓损伤严重，灰质变细、萎缩，神经元数量减少，呈损伤或坏死表现：神经元胞浆红染，尼氏体消失，细胞核浓缩或消失。后索白质有大片囊腔及空洞形成，周围胶质细胞增生，单核炎性细胞浸润。小剂量EPO治疗组脊髓损伤程度减轻，中等剂量和大剂量EPO治疗组的神经细胞损伤明显减轻，偶见胞浆红染和细胞核轻度浓缩，无明显空泡变性和炎性细胞浸润。对照组Caspase3染色显示灰质中许多神经元及胶质细胞呈阳性染色，给予小剂量rhEPO治疗后Caspase3阳性染色神经细胞数量有所减少，中等剂量和大剂量EPO治疗组Caspase3阳性细胞数与对照组具有显著性差异，中等剂量组与大剂量组Caspase3阳性细胞数无显著性差异(图3、4)。
   
　　电子显微镜显示对照组细胞胞浆水肿、细胞核损伤、轴索变性、髓鞘破坏断裂和线粒体损伤，EPO治疗可显著减轻脊髓损伤。Kaptanoglu评分显示EPO 100(P<0.05)、EPO 500(P<0.01)和EP0 1000(P<0.01)显著低于对照组的超微结构评分(图5、6)。
   
　　3  讨论
   
　　脊髓的机械冲击暴力可造成原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是暴力即刻引起的组织结构破坏，无法进行有效的干预。原发性损伤产生的细胞碎片和破裂的轴索等可诱导并引起一系列进行性生化和代谢变化，导致组织继发性损伤，主要是轴索髓鞘破坏、细胞凋亡和炎症反应。继发损伤发生于伤后数小时至数天，有比较从容的时机通过药物干预得到减轻。rhEPO曾被广泛应用于各种原因引起的贫血疾病，具有优良的安全性。近年来许多文献报道提出，EPO具有重要的神经保护作用［5］。免疫组化研究表明：正常脊髓组织中存在EPO及其EPO受体表达，特别是在神经元和有髓轴索上表达更多，损伤后8～48 h可见神经元和血管内皮细胞EPO及其受体表达明显增强［6］。rhEPO虽也是大分子，但已证实可通过血脊髓屏障，并达到神经损伤的治疗水平，在脊髓损伤时，透过血脊髓屏障的药物浓度更高，外源性EPO可与EPO受体结合，起到神经保护功能［7］。临床上从脊髓损伤到诊断明确后开始治疗往往需数小时或更长，既往文献报道的EPO治疗脊髓损伤的实验研究均为脊髓损伤后即刻给药，与实际情况存在一定差异。
   
　　本实验显示脊髓急性机械损伤后12 h给予rhEPO，下肢神经功能随时间逐步改善，损伤后1周时的HE染色及电子显微镜均可见EPO治疗组的脊髓损伤程度均轻于对照组，表明EPO可促进神经功能恢复，对抗脊髓的继发性损伤。可能的机制有EPO可抑制兴奋性氨基酸引起的细胞毒性及调节脊髓损伤后的血管形成，减轻血管痉挛，增加损伤部位的血供，从而减小损伤面积和程度［8］。其他可能机制还有EPO可减低细胞内钙离子浓度、NO产物、抗炎作用等［9、10］。

　　图1  矩形框示Caspase3阳性细胞计数的脊髓区域选择方法（略） 

　　图2  脊髓损伤后各组不同时间的下肢神经功能评分（略） 

　　图3  脊髓损伤后1周时，各组的Caspase3阳性细胞计数（略） 

　　图4  Caspase3免疫组化染色（略）   

　　4a.对照组，可见多数神经元(黑色箭头)和胶质细胞(白色箭头)的细胞核染色成茶色。可见明显空泡和囊性变(*)    4b.小剂量EPO组，可见多数细胞核染成茶色(黑色箭头)，部分神经元及胶质细胞核未染成茶色(白色箭头)    4c.中等剂量EPO组，可见大多数细胞核维持正常蓝色，部分神经元和胶质细胞核染成茶色(黑色箭头)    4d.大剂量EPO组，可见绝大多数神经元和胶质细胞核为蓝色，散在茶色细胞核(黑色箭头) 
　　图5  脊髓损伤后1周时，各组超微结构损伤评分（略） 

　　图6  脊髓损伤后1周时，各组超微结构的电子显微镜表现（略）   

　　6a.对照组，轴索变性，髓鞘呈蜂巢样变，与轴索分离，线粒体结构破坏消失，细胞核浓缩    6b.小剂量EPO治疗组，轴索水肿变性，髓鞘空泡样变，可见轻度脱髓鞘改变，线粒体变性，但结构仍存在，细胞核轻度损伤    6c、d.中等剂量和大剂量EPO组，轴索、髓鞘损伤明显减轻，线粒体，细胞核基本正常(m,线粒体；A.轴索；M.髓鞘；N.细胞核；*.脱髓鞘改变)
   
　　Caspase3是一种半胱氨酸蛋白水解酶，是引起细胞凋亡的最后通路。脊髓损伤后，线粒体破裂后释放出细胞色素c，可激活Caspase3，引起染色质浓缩、核小体裂开。既往常采用TUNEL染色反映细胞的凋亡情况，但假阳性率较高，而Caspase3染色特异性较好，假阳性率低。本研究显示脊髓损伤后给予EPO治疗，可显著减少Caspase3染色的阳性细胞数，提示EPO具有对抗细胞凋亡的作用，防止凋亡引起的组织破坏，保留部分脊髓功能。虽然凋亡被认为是一个非炎症性细胞死亡，不涉及细胞膜破裂和细胞内容物泄漏，但细胞凋亡后可继发产生炎性反应。EPO是具有抗炎作用的一种细胞因子，可减轻炎症引起的脊髓损伤。脊髓急性冲击损伤后，运动神经元及少突胶质细胞经历凋亡过程持续数日至2周左右，药物干预的时间比较从容。
   
　　本实验表明，脊髓损伤后12 h，rhEPO治疗可减轻脊髓损伤后继发性损伤，减轻髓鞘断裂、脱髓鞘损伤及细胞核、线粒体和轴索变性等。静脉单次给予500 IU／kg EPO可有效地保护神经元超微结构，给予1000 IU／kg超微结构评分略高于EPO 500 IU／kg治疗组，但未达到统计学差异。治疗脊髓损伤使用的EPO剂量远高于治疗贫血性疾病的剂量，大剂量EPO的安全性应进一步观察。多次静脉给药，体内有可能形成EPO抗体，阻碍EPO的生物学功能［6］。另外，EPO过量还可能引起红细胞增多，增加脊髓损伤部位血栓形成的危险，影响脊髓组织的修复。从安全性和经济性方面考虑，单次中等剂量EPO的剂量-效应关系较好。
   
　　本实验显示，脊髓冲击损伤后12 h给予rhEPO可减轻脊髓的继发性损伤，对抗神经细胞凋亡，保留和恢复脊髓功能，是一种令人鼓舞的脊髓损伤治疗药物，有可能为脊髓损伤的药物治疗提供另一种选择。脊髓急性损伤后的神经细胞凋亡和组织形态学变化的高峰为1周左右，本实验是初步定量分析，对于损伤后更长时间给予EPO的中远期疗效尚需进一步深入研究。
    　　

【参考文献】
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　　［3］ Drummond J C， Moore S S. The influence of dextrose administration on neurologic outcome after temporary spinal cord ischemia in the rabbit［J］. Anesthesiology, 1989, 70: 64-70.

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　　［10］Casadevall N, Nataf J, Viron B, et al. Pure redcell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin［J］. N Engl J Med,2002,346:469-475.

作者单位：北京大学人民医院 脊柱外科；病理科；电镜室，北京 100034;山东省郓城县人民医院骨科