副神经移位膈神经后膈肌运动诱发电位与病理学对照研究△

【摘要】  ［目的］探讨副神经移位膈神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能后膈肌的病理学变化及膈肌运动诱发电位(motion evoked potential，MEP)的特点。［方法］健康雄性SD大鼠60只。随机分为1～6个月6个时间组。取下颈部正中切口，将双侧副神经在锁骨下水平发出内、外侧支之前切断，移位缝接膈神经干起始部。术后第1～6个月各组样本取颈后正中切口，切除C３全椎板充分显露颈髓并于C3、４水平锐性横断。证实胫前肌MEP完全消失后，于两侧腋前线肋下缘作切口，显露该处膈肌腹腔侧。直视下将同心针电极于腋前线第9肋骨下缘垂直胸壁插入膈肌肋部，监测其MEP的变化。然后完整取出膈肌，于电子天平称重。并于右侧腋前线顺膈肌肌纤维方向切取2 mm宽肌条行HE染色。分析膈肌肌纤维截面积的变化。［结果］神经移位后随着时间延长，大鼠膈肌MEP潜伏期逐渐缩短，波幅逐渐增大。6个月组MEP波幅为（6.35±0.51）mV，潜伏期为（3.41±0.36）ms。同时，膈肌逐渐饱满，肌重逐渐恢复，6个月为正常对照组的(97.23±4.07)％。肌纤维截面积也逐渐增大，6个月组达（1 741±439）μm2为正常对照组（1 809±461）μm2的（98.28±3.65）％。6个月组的各数据与对照组比无显著差异(P>0.05)。［结论］从电生理及病理学来看副神经可作为运动神经移位膈神经重建高位颈髓损伤后呼吸功能。

【关键词】  膈神经； 副神经； 膈肌； 运动诱发电位； 病理学

　　高位颈髓损伤后，自主呼吸功能丧失，靠呼吸机辅助呼吸以维持生命，长期靠机械通气引发的并发症是高死亡率的主要原因［1］。因此提高高位颈髓损伤患者的生存质量，降低死亡率，重建呼吸功能尤为重要。周许辉等［2］将副神经作为运动神经移位膈神经重建高位颈髓损伤后膈肌的运动功能获得初步成功，但关于副神经移位膈神经后膈肌的MEP及病理变化未见报道。本文比较副神经移位膈神经后膈肌MEP、湿重、肌纤维截面积的变化，探讨副神经移位膈神经对恢复高位颈髓损伤后呼吸功能的可行性。为临床治疗提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验模型的建立
   
　　健康雄性SD大鼠60只，体重250～270 g。随机分为1～6个月6个时间组。3％戊巴比妥钠40 mg／kg腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台。10％硫化钠脱毛，手术野消毒后铺巾。手术操作在显微镜下完成。取两侧锁骨下切口，钝性分离胸大肌，暴露C7、C8及T1神经根，剔除副膈神经的大鼠。取下颈部正中切口，显露一侧胸骨舌骨肌及胸锁乳突肌，牵开后者于前、中斜角肌之间暴露C5、6神经根。以C5神经根为定标点确定并显露膈神经干。于C6水平游离膈神经，锐性切断。在锁骨上方从胸锁乳突肌外侧缘向外做一横切口长约5～6 mm，在斜方肌的深面肌筋膜下，仔细寻找副神经主干，并向远端游离至锁骨下水平在其发出内、外侧支以前切断。将副神经近侧断端与膈神经远侧断端用12-0医用无损针线缝合外膜。同法进行对侧手术。所有手术切口均撒青霉素粉剂，依次缝合手术切口。术后不作外固定，任其自由活动。

　　1.2  MEP的检测
   
　　术后第1～6个月各组样本取颈后正中切口，切除C３全椎板并于Ｃ３、４水平锐性横断脊髓。参照文献［3］的方法进行经颅电刺激检测膈肌MEP，将EEG阳极电极置于大鼠头颅中线皮下用Reporter型肌电图(Dantec公司，丹麦)给予单个方波脉冲刺激，刺激强度15 mA，波宽0.2 ms，刺激间隔200 ms。阴极针插入硬腭黏膜下。将同心电极针插入胫前肌证实MEP完全消失。于两侧腋前线肋下缘作切口，显露该处膈肌腹腔面。直视下于腋前线第9肋骨下缘垂直胸壁将同心圆针电极插入膈肌肋部。地线均置于胸骨处。各电极阻抗均<5 kΩ。滤波带通20～200 Hz，分析时程50 ms，平均20次，信号经放大后打印记录以备后续分析。每次将体重与各实验组相似的正常大鼠10只作为对照，在不损伤脊髓的情况下检测膈肌MEP。

　　1.3  膈肌湿重的测定
   
　　完成膈肌MEP检测后，将膈肌从起点处完整取下，并修净其周边的结缔组织，即刻称湿重(德国产R2000电子天平，精确度为0.01%kg)。分别与各时间点对照组膈肌湿重相除，得膈肌湿重恢复率。

　　1.4  膈肌肌细胞截面积测定
   
　　于右腋前线顺肌纤维方向切取约2 mm宽膈肌条，置于10％甲醛固定48 h，经梯度酒精脱水，浸蜡，在肌腹中部垂直肌纤维方向作厚5 μm切片，HE染色，甘油明胶封片。通过VIDSⅢ图像分析系统，在目镜放大20倍，定标值0.43 microns／pixel下测量膈肌肌细胞截面积。随机规定1根过中心的直线，测量经此直线上所有肌细胞截面积，取平均值作为该断面的肌细胞截面积。分别与对照组数值相除，得各时间点肌细胞截面积恢复率。

　　1.5  统计学数据处理
   
　　采用SPSS统计软件将各组得到的数据与对照组进行分析，P<0.05则提示有显著意义。

　　2  结果

　　2.1  膈肌MEP的变化
   
　　副神经移位膈神经随着时间延长，大鼠膈肌MEP潜伏期逐渐缩短，波幅逐步增大。6个月组MEP波幅为6.35±0.51 mV，潜伏期为3.41±0.36 ms，与正常对照组比较无显著差异。各时间组膈肌MEP潜伏期及波幅见表1。

　　2.2  膈肌的病理变化
   
　　副神经移位膈神经后第1个月，膈肌湿重下降最明显。随后，膈肌渐渐饱满，肌重逐渐恢复。6个月时为对照组的（97.23±4.07）％。同时发现，神经移位后第1个月，肌细胞萎缩。随着时间的推移，肌细胞截面积逐渐恢复，6个月组达（1 741±439）μm2，为对照组的98.28%±3.65%。膈肌湿重及肌细胞截面积恢复率见表2。
   
　　表1  副神经移位膈神经后膈肌MEP特点（略）

　　表2  膈肌湿重及肌细胞截面积恢复率（略）

　　3  讨论
   
　　膈肌是完成平和呼吸运动的主要动力来源。膈肌收缩而增加的通气量占平时呼吸时通气量的3／4～4／5［4］。膈神经核位于颈髓灰质C４前柱中央、运动神经元发出轴突主要经C4、5前根在前斜角肌外侧上份形成主干沿前斜角肌表面下行［5］。当高位颈髓损伤后，膈神经核受累，自主呼吸功能丧失。但副神经脊髓部神经核位于Ｃ４平面以上。因此，高位颈髓损伤后副神经诸多脊髓根仍保留大部分功能。周许辉等［2］将副神经作为动力神经移位膈神经恢复高位颈髓损伤后膈肌的运动功能获得初步成功，但目前关于副神经移位膈神经后膈肌的MEP及病理变化特点了解甚少。
   
　　MEP是刺激中枢神经组织并在脊髓远端、外周神经或肌肉中记录到的电信号。它经下行的锥体系和(或)锥体外系向下传导。能直接反映脊髓下行传导束和外周运动神经的功能状态［6］。波幅反映的是所测神经的数量和同步兴奋的程度，反映执行功能的神经和肌肉的总量。高位颈髓损伤后患者四肢瘫痪，自主呼吸功能丧失，神经传导通路中断，经颅刺激膈肌MEP波幅缺如。对于高位颈髓损伤大鼠，在副神经吻合膈神经后1个月，于腋前线第9肋骨下缘进针记录到膈肌MEP波幅，虽小但较稳定。而且随着时间的推移MEP波幅逐渐增大。6个月组达（6.35±0.51）mV。与正常大鼠膈肌MEP波幅比较无统计学差异。潜伏期是指从刺激起始到反应的某个部分之间的时间过程［7］。潜伏期的长短与神经纤维直径大小及传导最快的α运动纤维有关。本研究采用同心电极针记录膈肌MEP，来评价移位神经进入受体神经后的再生情况。实验均于头颅中线皮下给予强度、波幅及频率均相同的单个方波脉冲刺激，同于腋前线第9肋骨下缘进针插入膈肌肋部进行记录；使MEP传导通路长度一致。故MEP潜伏期的变化，表明神经纤维传导速度的变化。如果MEP潜伏期变短，神经传导速度增快，则表明再生神经的髓鞘增厚，且逐渐成熟。实验发现：术后第1个月潜伏期为（6.06±0.53 ）ms；随着时间的延长，该值逐渐缩短。第6个月为（3.41±0.36）ms。这种动态变化表明副神经移位膈神经后再生纤维的成熟，神经传导速度的加快，使MEP潜伏期逐渐缩短。通过对膈肌MEP的波幅及潜伏期的研究，说明副神经移位膈神经后，神经纤维能通过吻合口到达膈肌，在头颅给予的刺激产生的神经冲动经脊髓及移位后的神经传递到膈肌的运动终板并激活肌纤维而产生动作电位。
   
　　高位颈髓损伤后，膈神经核受累，膈肌因失去神经营养因子的肌营养作用及废用而发生萎缩。Sunder［8］发现肌细胞正常形态结构的维持须靠一些神经营养因子作用，失神经支配后最大变化的是这种神经营养因子丢失而导致的肌肉形态结构、生理、生化及新陈代谢等方面的改变。肌肉失神经支配后颜色较正常苍白，肌肉湿重减轻。Pellegrino等切断大鼠坐骨神经后4周丧失肌重55％，马建军等［9］用膈神经作为移位神经，与肌皮神经缝接以恢复大鼠臂丛神经根性撕脱伤的屈肘功能。术后1个月，肱二头肌肌重恢复率为（55.62±1.81）％，肌重丧失了44.38％。本研究发现：副神经移位膈神经后第1个月膈肌肌重恢复率为（51.29±2.73）％，肌重丧失48.71％。这与2位作者的研究结果较为相近。Polentes等［10］认为肌肉失神经支配后其形态上的变化主要表现为肌纤维明显减少，细胞核增加，胞浆丢失，肌细胞截面积减小，但肌纤维结缔组织增生及组织间水分增多。因此，肌细胞截面积的丧失比肌重为多。本组观察发现在神经移位早期肌重的丧失较肌细胞截面积为少。但随着时间的延长，到达肌肉的神经再生轴束数量的增多，神经纤维中原支配模式的恢复，肌细胞间结缔组织逐渐减少，肌细胞截面积恢复较快。
       
　　总之，副神经移位膈神经后随着时间延长，膈肌MEP潜伏期逐渐缩短，波幅逐渐增大。同时，膈肌渐渐饱满，肌重逐渐出现恢复，肌纤维截面积也逐渐增大。这表明副神经移位膈神经后随着时间的推移，到达膈肌的再生轴束数量在增加，神经纤维中原来的支配模式在逐渐恢复。而神经肌肉结构的变化是功能恢复的基础。因此从电生理及病理学角度来分析，副神经可作为动力神经移位膈神经来重建高位颈髓损伤后呼吸功能。
   

【参考文献】
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　　［2］ 周许辉，贾连顺，李家顺，等.副神经移位重建高位颈髓横断伤大鼠膈肌运动功能的初步研究［J］．中国矫形外科杂志，2003，11(50)：325-327．

　　［3］ Lissens MR，Vanderstracten GG．Motor evoked potentials of the respiratory muscles in tetraolegic patients［J］．Spinal Cord，1996，34：673-678．

　　［4］ Kireger LM，Krieger AJ．The intercostals to phrenic nerve transfer： an effective means of reanimating the diaphragm in patients with high cervical spine injury［J］．Plastic and Reconstructive Surgery,2000,4：1255-1261．
　　
　　［5］ Polentes J，Stamegna JC，NietoSampedro M，et al．Phrenic rehabilitation and diaphragm recovery after cervical injury and transplantation of olfactory ensheathing cells［J］. Neurobiol Dis,2004,16:638-653.

　　［6］ Verin E, Ross E, Demoule A, et al. Effects of exhaustive incremental treadmill exercise on diaphragm and quadriceps motor potentials evoked by transcranial magnetic stimulation［J］. J Appl Physiol,2004,96:253-259.

　　［7］ Day MJ, Jonville S, Chatwin M, et al. Exerciseinduced depression of the diaphragm motor evoked potential is not affected by noninvasive ventilation［J］. Respir Physiol Neurobiol, 2006, 23:58-61.

　　［8］ Sunder LS. Factors influencing the development and severity of the changes in denervated muscle. Nerve injuries and their repair［M］. London: Churchill Living Stone, 1991,247-249.

　　［9］ 马建军，顾玉东，陈德松，等.膈神经移位直接缝接与神经种植治疗臂丛根性撕脱伤实验研究［J］.中华手外科杂志，1994, 1: 12-15.

　　［10］Polentes J, Stamegna JC, NietoSampedro M, et al. Phrenic rehabilitation and diaphragm recovery after cervical injury and transplantation of olfactory ensheathing cells［J］. Neurobiol Dis，2004, 16:638-653.

作者单位：第二军医大学长征医院骨科，上海 200003