一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究△

【摘要】  ［目的］探索胶原/壳聚糖/纳米β磷酸三钙一体化层状梯度修复体在组织工程中用作骨软骨缺损修复的可行性。［方法］以Ⅰ型胶原、壳聚糖、纳米β磷酸三钙（βTCP）为基本原料，采用无毒交联并通过冷冻干燥法成型；扫描电镜观察，测定支架材料的孔径、孔隙率以及交通孔情况；分离扩增兔骨髓间充质干细胞（BMSC），将BMSC接种于材料上，扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态，MTT法测定细胞在材料上的生长曲线；以软骨诱导液体外诱导细胞支架复合物向软骨分化，2周后植入自体股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化效果。［结果］材料疏松多孔，孔径大于100μm，孔隙率大于95％。细胞在材料上黏附状态良好，并且增殖迅速。BMSC材料复合体经体外三维诱导后可在自体异位向软骨分化。 ［结论］Ⅰ型胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化层状梯度修复体具有良好的孔隙结构和生物相容性，有望成为一种新型的组织工程支架材料用于骨软骨缺损修复。

【关键词】  组织工程； 骨软骨； 骨髓间充质干细胞； 胶原； 纳米β磷酸三钙

    Research on a novel bilayered scaffold being used in tissue engineering(TE)of osteochondral repair∥BAI Xuedong,HU Yunyu,YAN Leping,et al.Institute of Orthopaedic Surgery of PLA at Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi`an 710032,China

    Abstract：［Objective］To explore the potential of a novel collagen I / chitosan /Nanoβtricalcium phosphate(βTCP)bilayered scaffold for being used in tissue engineering(TE)of osteochondral repair.［Method］Bilayered scaffolds were produced with collagen Ⅰ,chitosan andβTCP,using a special crosslinking and freeze drying method.The pore size,porosity and interpores of the scaffold were observed by scanning electron microscopy(SEM).Rabbit bone mesenchymal stem cells （BMSC）were isolated and amplified,then inoculated onto the scaffold.By SEM scanning,the condition of the cells adhering onto the scaffold was observed.The proliferation of the cells on the scaffolds was examined using MTT method,and the growth curve was drawn.The cellscaffold composite were then induced to differentiate towards cartilage by 3D culturing,and then implanted into muscle pouches 2 weeks later.The result was observed 6 weeks later by HE staining,toluidine blue staining and type Ⅱ collagen immunohistochemistry.［Result］The scaffold possessed high porosity and proper pore size,the porosity was above 95%.BMSC could adhere onto the scaffold well,and the proliferation rate of the cells on the scaffolds was perfectly good.After in vitro induction,BMSCscaffold composite can differentiate toward cartilage ectopicly.［Conclusion］The novel collagen I / chitosan /βTCP bilayered scaffold possesses good pore structure and biocompatibility,and will possibly become a new biomaterial of TE used for osteochondral repair.

    Key words：tissue engineering(TE);  osteochondral;  bone mesenchymal stem cells(BMSC);  collagen;  Nanoβtricalcium

    组织工程学的发展为软骨损伤修复提供了新的方法，可有效地解决移植物来源以及供区损伤问题，并且移植物可以在体外任意塑形，以适应损伤部位的需要〔1〕。软骨缺损的修复包含2个主要方面：（1）以功能性修复组织填充缺损；（2）修复组织与周围宿主软骨和骨的整合〔2〕。目前软骨组织工程中存在的一个突出问题是移植物与宿主组织间缺乏稳固的锚定，单纯依赖软骨软骨界面微弱的连接往往难于达到满意的修复效果〔3〕。

    为有效解决移植物与宿主组织的整合问题，作者研制了一种新型组织工程骨软骨一体化材料——胶原/壳聚糖/βTCP一体化层状梯度修复体。该材料在结构上分为上层的软骨部分和下层的软骨下骨部分，但整个材料一体化交联，避免了软骨与骨部分在修复过程中分离。凭借骨组织之间快速而牢固的整合，有望使整个修复体在早期稳固地锚定于缺损区，为关节软骨的修复提供良好的稳定性和机械支持。

    本实验对该组织工程骨软骨一体化修复体的一般性能以及体外生物相容性进行了研究，并且通过体外诱导以及自体异位实验初步探讨其用于组织工程骨软骨损伤修复的可行性。

    1  材料和方法

    1.1  胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化层状梯度修复体的研制

    支架材料由华南理工大学生物材料研究所研制提供，以Ⅰ型胶原、壳聚糖为基材,与具有良好生物活性的βTCP粉体共混交联，经冷冻干燥成型。上层为胶原/壳聚糖，下层为胶原/壳聚糖/βTCP，无机粉体含量由下到上呈梯度变化。

    1.2   支架材料的形态和孔隙率

    以排水法测材料的孔隙率，扫描电镜观察材料的孔隙大小以及孔隙贯通情况。

    1.3   MTT法测细胞在支架材料上的增殖活性

    取3个月龄日本大耳白兔，体重2.1 kg，常规麻醉消毒后自胫骨平台下0.5 cm处以18号穿刺针穿刺，两侧各抽取骨髓2～3 ml，小心加入预装有等体积percoll工作液（密度1.073）的离心管，以2 000r/min离心25 min后收集有核细胞层，重悬于含10％新生牛血清（GIBCO）的高糖DMEM培养液中，接种于100 ml培养瓶，于37 ℃、体积分数为5％ CO2的孵箱中培养。3 d后首次换液，以后每2～3 d换液，待原代细胞80%铺满瓶底时传代。

    取第2代细胞，胰酶消化后制成3.0×105个/ml的细胞悬液。在48孔板内放置20块同等型号的材料，以滴注法将细胞悬液接种于材料，每块材料150 μl；另将5块材料以单纯培养液滴注用做对照。培养箱内静置4 h后，每孔加入培养液700 μl以充分覆盖材料，18h待细胞完全贴壁后，将复合有细胞的材料转移至新孔，每孔加培养液1.5 ml，以后每2 d给予换液。分别在转孔后第2、4、6、9和12 d随机选取3块复合细胞的材料和1块对照材料，每孔加入700 μl培养液和70 μl 5 mg/ml的MTT溶液，于培养箱内4 h后吸弃各孔内液体，并在各孔加入700 μl DMSO，微量振荡器上振荡10 min后，每孔吸取150 μl液体加入96孔板用作检测。选择492 nm波长，以对照孔调零，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。以时间点为横坐标，各时间点MTT均值为纵坐标绘制生长曲线。

    1.4   扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态

    将细胞悬液以3.0×105个/ml的密度接种于支架材料，置24孔板内培养12 d后以3%的戊二醛固定，梯度酒精脱水，叔丁醇置换，真空干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜下观察细胞在材料表面及内部的黏附形态。

    1.5   MSCs在支架材料上的诱导分化

    取3个月龄日本大耳白兔，体重2～2.5 kg，依上述方法分离扩增兔BMSC。取第2代细胞，消化后配成2×106个/ml的细胞悬液，将细胞悬液在24孔板内接种于支架材料，每块材料150 μl，于培养箱内静置4 h后，加2 ml培养液继续培养。24 h后将材料转移至新孔，并将培养液更换为以高糖DMEM配制的成软骨诱导液(含rhTGFβ1 10μg/L，地塞米松1×107 mol/L，VitC 50 μg/L，新生牛血清100 ml/L)，以后每2 d换液。持续诱导培养14d后，将实验动物常规麻醉消毒，分别切开股部皮肤、皮下及筋膜，沿肌纤维走行钝性制造肌袋。左侧植入空白载体为对照侧；右侧植入经诱导的细胞-支架复合体为实验侧。术后6周后取材，制成石蜡切片行HE、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定软骨分化情况。

    2   结  果

    2.1   材料的形态和孔隙率

    SEM可以观察到支架材料具有疏松多孔结构，孔隙结构规则，孔径约100～150 μm，材料内部孔与孔之间贯通良好（图1）；纳米TCP被包裹在修复体表面，两者结合紧密，颗粒分布均匀（图2）。通过排水法测定材料的孔隙率大于95%。

    2.2   细胞在材料上的黏附状态和增殖曲线

    SEM显示BMSC在材料上经三维培养14 d后生长状态良好，细胞成片地黏附于支架表面及孔隙侧壁,并可见细胞间通过突起相互连接成片（图3）。

    图1支架内部孔隙结构(SEM×100)  图2包裹β-TCP的支架表面(SEM×2 000)  图3细胞在材料表面的黏附形态（SEM×500）    BMSC在材料上增殖迅速，三维培养12 d，MTT值由2 d时的0.255上升至1.557，细胞基本呈现对数生长趋势，其中4～6 d、9～12 d期间增殖最为显著（P＜0.05）；但6～9 d期间增殖不显著(P＞0.05)（图4）。

    2.3  MSC支架自体异位成软骨实验

    术后2周可在动物实验部位触及质韧小结节，以后实验侧结节逐渐变硬，而对照侧则无明显变化。实验侧支架材料经过体外培养2周、体内6周后大部分降解，但仍可见残留支架的轮廓（深红染色），支架孔隙内充填成团的类软骨组织，未见明显炎症反应（图5）。甲苯胺蓝染色见材料内部大量异染组织，细胞及细胞外基质均有明显着色（图6）。Ⅱ型胶原免疫组化可见新生组织呈阳性反应（图7）。

    3  讨  论

    支架材料是组织工程研究中的重要课题，理想的软骨组织工程支架材料应具备以下特点：（1）良好的生物相容性，其本身或降解产物对种子细胞和机体无毒性，不会引起炎症和免疫排斥反应；（2）适宜的生物降解性，降解速度需和组织再生速度相匹配，最后可完全吸收；（3）良好的结构相容性，具有一定的强度和可塑性,能保持稳定的三维立体结构，多孔的三维支架应具有互相连通的孔隙，以利于营养物质和代谢产物的扩散。孔隙率在85%以上，孔径大小适当，为种子细胞的均匀分布和生长提供足够的空间；（4）良好的表面相容性和一定的生物活性，材料表面有利于种子细胞的黏附与生长〔4〕。作者所应用的组织工程骨软骨支架材料以细胞相容性良好的Ⅰ型胶原、壳聚糖为主体，通过特殊设计的交联冻干技术，使支架材料在一体化的前提下将纳米TCP粉体均匀的混于材料的下层，借以发挥其促进成骨的作用。实验证明支架材料具有良好的孔隙结构和孔隙率，无细胞毒性并且有利于附着的种子细胞增殖，为体外进行三维培养奠定了基础。生长曲线上（图4）第6～9 d细胞增殖不明显，分析原因可能是随着细胞数量的增加，其对营养的需求量亦增加，1.5 ml/2d的换液量已远不能满足大量细胞增殖的需要，从而导致细胞因缺乏营养供应而增殖受限；以后改为每日换液，到第12 d时MTT值迅速上升。材料亦具有良好的降解性能，体外培养2周后材料的大体形状以及孔隙结构基本保持不变，而体内6周后则大部分降解，但材料的基本轮廓依然保存，基本满足组织工程对材料降解性能的要求。

    图5细胞支架复合物植入肌袋6周（HE染色×100）  图6细胞支架复合物植入肌袋6周（甲苯胺蓝染色×200）  图7细胞支架复合物植入肌袋6周，Ⅱ型胶原免疫组化（×400）    由于软骨细胞来源受限并且存在供区损伤等一系列不利因素，故本实验采用BMSC作为种子细胞。自体BMSC取材方便,不存在免疫排斥反应,同时具有体外扩增能力强、自我更新快、多向分化潜能等特点，是骨软骨组织工程最为理想的种子细胞〔5〕。BMSC不但可在体外诱导为软骨细胞或骨细胞，还可在体内受不同的生长环境刺激分化为软骨或骨〔6〕。BMSC向软骨或成骨方向分化需要特定的培养条件,虽然平面培养及三维培养条件下均可成功诱导BMSC向软骨细胞分化，但合适三维培养条件下更有利于软骨或骨表型的维持〔7〕。本实验分离扩增了成年兔BMSC，将其与支架材料复合进行体外三维培养，证实了材料具有很好的生物相容性，适合于BMSC的生长增殖；进而对细胞材料复合物进行三维成软骨诱导，证实了在适当的诱导条件下，材料上的细胞可向软骨分化。由于纳米TCP具有良好的生物降解性和骨传导性，纳米TCP/胶原复合体被认为是最能满足骨组织工程需要的支架材料之一〔8〕。实验发现支架材料体外培养2周后下层的TCP粉体发生明显矿化，其在本研究中成骨方面的作用尚有待进一步实验证实，但已有文献表明，纳米磷酸三钙不仅可作为BMSC的细胞骨架,而且还可以加速骨的形成〔9〕〔10〕。

    结论：胶原/壳聚糖/纳米β磷酸三钙一体化层状梯度修复体具有良好的物理性能和生物相容性，适合于BMSC三维诱导培养，有望成为一种新型组织工程支架材料用于骨软骨损伤修复。

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〔7〕 Martin I,Shastri VP,Padera RF,et al.Selective differentiation of mammalian bone marrow stromal cells cultured on threedimensional polymer foams［J］.J Biomed Mater Res,2001,55(2):229235.

〔8〕 Zou C,Weng W,Deng X,et al. Preparation and characterization of porousβtricalcium phosphate/collagen composites with an integrated structure［J］.Biomaterials,2005,26(26):52765284.

〔9〕 Erbe EM,Marx JG,Clineff TD,et al.Potential of an ultroporous betatricalcium phosphate synthetic cancellous bone void filler and bone marrow aspirate composite graft［J］.Eur Spine J,2001,10(2):141146.

〔10〕 Chen JD,Wang YJ,Wei K,et al.Selforganization of hydroxyapatite nanorods through oriented attachment［J］.Biomaterials,2007,28:22752280.

作者单位：1.第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安 710032；2.华南理工大学特种功能材料教育部重点实验室，广州 510641