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首页医源资料库在线期刊中国矫形外科杂志2007年第15卷第22期

骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究

来源:《中国矫形外科杂志》
摘要:【摘要】探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子,寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-I单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养,应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子,并将其与骨髓基质干细......

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【摘要】  探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子,寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-I单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养,应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子,并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物,直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处,并与对照组相比较,观察软骨修复效果。[结果]常规形态学观察,rhTGF-β1和rhIGF-I联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞,免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化,修复缺损的软骨,缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。[结论]rhTGF-β1和rhIGF-I联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合,骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。

【关键词】  细胞因子 骨髓基质干细胞 软骨细胞 软骨缺损

    Experimental study on regeneration of articular cartilage defects with bone marrow stromal cells∥TONG Peijian, LI Ju,JI Weifeng,et al.Postgraduation Institute,Fudan University, Shanghai 200032,China

    Abstract:[Objective]To retrieval a best cell factor which can induce bone marrow stromal cells (bMSCs) into chondrocyte in vitro and to explore an effective plan to repair rabbit's chondrocyte defect.[Method]Isolated bMSCs were cultured in vitro. rh Fibroblast Growth Factor 1(rhFGF-1)、rh Transforming Growth Factor-β1(rhTGF-β1)、rh Insulinlike Growth Factor-Ⅰ(rhTGF-Ⅰ) were utilizated. The proliferation of  cells was detected by MTT assay, and the macroscopic histology , HE staining and immunohistochemical examinations were performed  to seek the best cell factor. In vivo , to investigate the repair of the articular cartilage, bMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-β1、rhIGF-I was compared with control group.[Result]The cells induced by rhTGF-β1 and rhIGF-I were similar to chondrocytes in morphology, and immunohistochemical examinations showed the cells possessed phenotype of chondrocytes. RhTGF-β1 and rhIGF-I could differentiate bone marrow stromal cells into cartilage cells in vivo, and repair the articular cartilage defect. The control group could not repair the articular cartilage defect efficiently.[Conclusion]rhTGF-β1 and rhIGF-I are best group which stimulate bMSCs to differenate into cartilage cells. BMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-β1、rhIGF-I can repair the articular cartilage defect.

    Key words:cell factor;  bone marrow stromal cells;  chondrocyte;  cartilage defect

    作者简介:童培建(1961-),男,杭州人,教授,主任医师,在读博士研究生,研究方向:关节外科,(电话)0571-87070956    骨髓基质干细胞(BMSCs)中含有少量的多功能基质干细胞,能向成骨系细胞、成软骨系细胞分化[1],为骨、软骨组织的损伤提供了潜在的修复可能。临床软骨缺损自行修复的效果较差,可能跟软骨损伤局部BMSCs的含量少有关。因此作者通过对BMSCs在体外扩增培养、应用不同的细胞因子进行诱导,从中寻找体外促进骨髓基质干细胞增殖分化的最佳条件,并将细胞因子与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物,植入缺损处,探讨体内修复家兔软骨缺损的效果。

    1  材料与方法

    1.1  骨髓基质干细胞的取材与培养

    取新生红皮胎兔2只(24 h内),置入浓度为75%的酒精中浸泡消毒5 min,在超净工作台中,无菌分离四肢长骨骨干,剔除软组织,在10%的DMEM培养液中剖开骨干,反复吹打髓腔。将细胞悬液移入离心管中,加入Hank's液至10 ml,平衡,1 500 r/min离心10 min,弃上清,加入10% DMEM,反复抽吸吹打均匀,计数,按1×107接种于25 ml培养瓶中,37℃ 5%饱和湿度培养箱中常规培养。5 d后首次全量换液,以后每3 d换液1次,待细胞融合至80%时,0.25%胰蛋白酶常规消化,按1:3比例传代培养。逐日倒置显微镜观察培养细胞的生长情况。

    1.2  体外实验分组 

    实验分组如下:rhFGF-1组(简称F组);rhIGF-Ⅰ组(简称I组);rhTGF-β1组(简称T组);rhFGF-1+ rhIGF-I组(简称F+I组);rhFGF-1+ rhTGF-β1组(简称F+T组);rhIGF-I+rhTGF-β1组(简称I+T组);rhFGF-1+rhIGF-I+rhTGF-β1组(简称F+I+T组);对照组(不加任何试剂)。其中rhFGF-1浓度为10 μg/L; rhIGF-I浓度为10 μg/L; rhTGF-β1 I浓度为5 μg/L。

    1.3  MTT比色法测定 

    取第2代骨髓基质干细胞以1×104/ml接种到96孔培养板上,共4块,常规培养24 h。待细胞完全贴壁后,弃上清液,将每块孔板随机分组,每组8孔,按实验分组添加相应的细胞因子,分别于第1、3、6、9 d各取孔板1块,进行MTT检测:即每孔加50 mg/ml的MTT液20 μl,常规培养4 h,弃废液,0.1%PBS液清洗1次,加入二甲亚砜,每孔150 μl,静置20 min后,用酶标仪测定波长为490 nm的吸光度值。

    1.4  体外细胞形态学观察

    将细胞进行HE、Ⅱ胶原免疫组化测定(ABC法),倒置显微镜下观察。

    1.5  纤维蛋白凝胶复合体的制备 

    传代培养的骨髓基质干细胞经0.1%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后,1000 r/min离心10 min浓集,进行细胞计数。制成单细胞悬液,与纤维蛋白原溶液混匀。使纤维蛋白原和骨髓基质干细胞的终浓度分别为2.5 g/L和5×106/ml,每毫升再加入rhTGF-β 15 ng/5 μl和rhIGF-I50 ng/50 μl。然后加入凝血酶20 U/ml。制成凝胶备用(2 h内使用)。

    1.6  体内实验分组

    32只家兔,雌雄不限,随机分为4组。无菌条件下后肢右股骨髁滑车关节面钻孔,直径3.5 mm、深3.0 mm,达软骨下骨。干细胞复合体组:缺损中直接种植纤维蛋白凝胶复合体;单纯凝胶复合体组:缺损植入未加细胞因子的凝胶复合体;骨髓基质干细胞注射组:缺损单纯注射浓度为5×106/ml骨髓基质干细胞悬液0.5 ml;空白组:缺损不作处理。不固定术肢,自由活动。分别于4、8、12周处死取材。标本10%福尔马林固定。行HE、Masson三色、甲苯胺蓝染色检查。第12周标本行透射电镜检查。

    1.7  体内组织形态学评分 

    参照O'Driscoll,Keeley and Salter组织形态学评分标准。对实验组和对照组修复组织形态学进行半定量评分(表2)。

    1.8  统计学处理 

    实验数据用±s表示,显著性检验采用t检验。P<0.05为差异有显著性。使用SPSS 11.5统计软件进行数据统计处理。

    2  结  果

    2.1  体外细胞形态学观察

    贴壁细胞呈梭形、纺锤形、多角形等,有不规则的生长突生出,细胞基质折光性强;4~5 d后细胞形成集落状,形态比较单一,基本上呈梭形或多角形;7~8 d后形成单层。

    首次传代的细胞呈圆形,24 h后恢复梭形,折光性好,细胞呈均匀生长,形态更加单一,基本呈梭形。8 d后可铺满瓶底,形成单层结构,排列呈有规律的方向性(图1)。经生长因子诱导的细胞,对照组、T组生长速度有所减慢,10 d左右形成单层结构;I+T组形态由梭形变为以扇贝形或多角形为主,细胞核深染(图2);F组生长加快,在5 d形成单层,形态以长梭形为主(图3)。免疫组化染色显示:细胞基质呈棕黄色,染色较均匀,证明Ⅱ胶原存在[2],部分细胞不着色(图4)。细胞经苏木素复染后可见细胞核深染,免疫组化染色后的细胞形态在镜下成圆形、椭圆形或多角形,不同于前2代的细胞形态(图5)。免疫组化染色(随机镜野)阳性率面积接近50%(图4、6)。图1  p1代 4×10  图2  HE(I+T组)10×40  图3  HE(F组)10×20  图4  免疫组化(I+T组)10×20  图5  免疫组化(I+T组)10×40  图6  免疫组化(I+T组)10×20

    2.2  诱导细胞增殖测定(MTT) 

    第1、3 d MSCs细胞处于增殖静止期;细胞在第3 d开始进入对数增殖期,细胞增殖迅速,以F组增殖最为显著,第6 d达到高峰;第9 d多数实验组进入增殖平台期,增殖速度相对减缓,而I+T组仍保持增殖的趋势(见表1)。MTT测定3 d时各组细胞均有不同程度的增殖;6 d时F组、I组、F+I组、F+T组细胞增殖较快,与对照组相比,P<0.01,其它组细胞增殖速度不明显;9 d时,F组、F+T组、F+I+T组与对照组相比有统计学意义(P<0.01);F+I组P<0.05。表1  生长因子在不同时间对MSCs的增殖活性的影响注:*与对照组比较P<0.05;**与对照组比较P<0.01;

    2.3  修复软骨的大体观察 

    术后4周,干细胞复合体实验组标本可见缺损处由白色、半透明类软骨样组织所填充,与正常软骨组织界限清楚,表面不光滑。术后8周,缺损处修复组织变成乳白色,半透明光滑组织,与周围软骨组织边界开始变模糊。术后12周,缺损修复组织与周围正常软骨组织已基本难区分,表面平坦(图7)。单纯凝胶复合体组12周缺损呈乳白色,表面平坦,边界模糊。骨髓基质干细胞注射组12周缺损处凹陷,肉芽组织生长(图8)。空白组12周缺损处肉芽组织填充表面仍稍凹陷,与周围正常软骨组织界限仍清楚。

    2.4  修复软骨HE染色

    第12周干细胞复合体实验组的修复软骨与正常软骨整合良好,各层结构清晰,新生软骨细胞数量明显增多,排列已经类似正常软骨,潮线明显,表面未见裂缝(图9)。空白组修复组织内见少量的细胞,细胞形态异常,纤维组织填充。单纯复合体组见细胞数量增多,形态正常,与周围组织整合良好。

    2.5  修复软骨Masson三色

    干细胞复合体实验组12周,软骨细胞数量多,排列较前规则,软骨表面光滑,与周围组织整合良好,可见亮绿色胶原纤维,修复的软骨与软骨下骨质紧密结合。

    2.6  修复软骨甲苯胺蓝染色

    干细胞复合体实验组12周时,甲苯胺蓝染色与正常软骨接近,修复的组织呈现出均匀的异染性着色,软骨深层染色浓,细胞形态大。单纯凝胶复合体组,基质染色浅,细胞陷凹少。骨髓基质干细胞注射组,细胞较少,基质呈浅蓝色(图10)。空白组,细胞少,基质染色颜色浅蓝色。

    2.7  修复软骨电镜检查

    干细胞复合体实验组软骨细胞具有典型的褶皱状小突起,细胞周围还可见到许多长纤毛,并延伸到细胞外基质中。高倍电镜显示干细胞复合体实验组的修复软骨细胞细胞核增大,核内常染色体增多。细胞质内可见粗面内质网排列整齐、紧密,膜表面附有大量的核糖体颗粒。胞质内细胞器数量增加。软骨细胞周围的外基质中可见胶原纤维成束状紧密排列,可见到周期性横纹(图11)。单纯凝胶复合体组修复的软骨细胞结构正常,但细胞表面未见纤毛。高倍镜下软骨细胞胞质内粗面内质网数量少,排列较稀疏,高尔基体数量也减少。细胞核较干细胞复合体实验组明显小。细胞周围胶原纤维排列紊乱,稀疏。骨髓基质干细胞注射组电镜下观察基本类似于空白组。大多为凋亡软骨细胞,细胞水肿胀大,细胞核固缩,细胞质内见不到细胞器(图12)。偶尔可见未坏死的软骨细胞,但细胞形态小,成梭形。细胞周围纤维束排列稀疏。

    2.8  修复软骨的组织形态学评分及统计分析(表2)表2  修复后软骨组织形态学分值注:*与干细胞复合体实验组比较P<0.05,△与空白组比较P>0.05,▲与空白组比较P<0.05图7  术后12周,干细胞复合体组缺损修复组织大体照片  图8  术后12周,单纯骨髓基质干细胞组缺损修复组织大体照片  图9  第12周干细胞复合体实验组的修复软骨与正常软骨整合良好,新生软骨细胞数量明显增多,排列已经类似正常软骨。HE 100×  图10  第12周单纯骨髓基质干细胞组的修复软骨细胞较少,基质呈浅蓝色。甲苯胺蓝100×  图11  干细胞复合实验组12周,软骨细胞周围的外基质中可见胶原纤维成束状紧密排列。12 500×  图12  空白组12周,大多为凋亡软骨细胞,细胞水肿胀大,细胞核固缩,细胞质内细胞器很少。1 650×

    3  讨  论

    许多证据表明[3],MSCs可以在不同理化环境的细胞因子的诱导下,定向的向成骨细胞或成软骨细胞系方向分化,并最终形成骨或软骨组织。在细胞生存微环境中,生长因子对细胞增殖、分化、发育和成熟过程起重要的调控作用。

    bFGF对MSCs的作用还不是很明确,但主要认为促增殖作用。另外,bFGF能促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原,对维持软骨细胞正常表型的表达具有重要的作用。IGF1能刺激细胞分裂增殖,而且增强细胞蛋白多糖(PG)及Ⅱ型胶原的合成[4]。TGFβ是一种多功能性的细胞因子,可以显著提高软骨细胞表型的表达,促进软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成与分泌。TGF-β诱导MSCs后经连续培养,可以在体外形成软骨结节,经证明具有软骨的组织结构[5]。

    本实验中作者发现,细胞因子单独应用时,bFGF-1的促增殖作用最显著,倍增时间最短;其次分别是IGF1和TGFβ,这与以往的实验研究相符[6]。然而,当联合应用细胞因子时,发现bFGF1与其它因子组合的增殖作用部分受到抑制,不如单独应用bFGF-1作用显著。同时作者发现,IGF1和TGFβ联合应用时,细胞的对数增殖期最长,诱导细胞呈持续的增殖状态,这可能是IGF1和TGFβ联合应用,使各自的半衰期延长,能够更持久的调节细胞的生物学行为,使之保持生物学活性。IGF1和TGFβ联合应用时,部分集落的骨髓基质干细胞呈大而圆形或多角形,通常认为,圆形、多角形的细胞体外能够保持合成软骨特异性Ⅱ型胶原及蛋白多糖的功能。免疫组化染色阳性面积较其它组大;而对照组与其它实验组细胞集落多数呈长梭形,以往认为这是软骨细胞去分化的表现(dedifferentiation)。Ⅱ型胶原蛋白是软骨细胞所特有的胶原类型,是软骨细胞重要的表型蛋白,免疫组化结果揭示MSCs经IGF1和TGFβ联合诱导可以向软骨细胞方向增殖分化。实验研究结果表明,IGF1和TGFβ联合应用是诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化的最佳组合,能促进Ⅱ型胶原合成和表达。在体内作者采用TGFβ及IGFⅠ作为骨髓基质干细胞向软骨细胞转化的诱导因子,以纤维蛋白凝胶作为前者的载体。纤维蛋白凝胶可通过释放β转化因子和血小板衍生生长因子等来促进细胞黏附、增殖并分泌基质,起到骨髓基质干细胞的支架作用,能很好地包埋骨髓基质干细胞和软骨细胞。此外,IGFⅠ在体内可以通过与软骨细胞膜上的受体结合以旁分泌和自分泌的方式起作用。因此IGFⅠ可以不进入血液,而在局部与细胞发生作用。

    实验表明在体内联合应用IGF1和TGFβ,能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞的分化。在12周时修复组织为透明软骨,病理切片提示修复组织与正常软骨组织结构类似,并且与周围组织整合良好。电镜观察也发现,联合应用TGFβ及IGF1修复组织的软骨细胞形态正常,细胞活跃,基质内纤维组织结构符合软骨特性。软骨修复是一个复杂的过程,有多种细胞因子参与。缺少细胞因子的单纯凝胶组和骨髓基质干细胞注射组均不能达到较好的软骨修复效果。因此,TGFβ及IGF1联合可作为组织工程学修复软骨的首选细胞因子。

 

【参考文献】
  [1] Bianco P, Riminucci M,Gronthos S,et al. Bone marrow stromal stem cells nature biology and potential application[J]. Stem Cell,2001,19(3):180-192.

[2] 段小红,毛 勇,王惠芸,等.髁突骨上组织改建中Ⅰ、Ⅱ型胶原的免疫组化研究[J].华西口腔医学杂志,2000,18(2):81.

[3] 丁 坚,曾炳芳,张先龙,等.骨膜覆盖对骨髓基质细胞移植修复软骨缺损的影响[J].中国矫形外科杂志,2004,14(5):360-364.

[4] Zhang J, Li Y, Chen J,et al.Expression of insulin like growth factor 1 and receptor in ischemic rats treated with human marrow stromal cells[J]. Brain Res,2004 ,1030(1):19-27.

[5] 陈富林,毛天球,丁桂聪,等. 转化生长因子-β诱导骨髓基质干细胞团体外形成软骨的观察[J]. 华西口腔医学杂志,2003,21(2):92-94.

[6] 焦岩涛,王大章,韩文利,等.bFGF、IGFI及TGFβ1对人髁突软骨细胞增殖的影响[J].中华口腔医学杂志,2000,35(5):246-349.


作者单位:复旦大学研究生院,上海 200032

作者: 童培建 2008-5-30
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