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【摘要】 ［目的］应用无机化学材料合成碳酸化羟基磷灰石骨水泥，并通过发泡成孔的新方法制备能原位固化形成多孔结构的无机植骨材料。［方法］(1)以碳酸钙、磷酸氢钙等化学试剂为原材料，通过高温烧结合成碳酸化羟基磷灰石粉体。再以磷酸氢二钠和磷酸二氢钠合成浓度为0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液，作为固化液。粉体与固化液以1 g/0.4 ml相混合，原位固化形成碳酸化羟基磷灰石;(2)在碳酸化羟基磷灰石粉体中加入成孔剂，成孔剂在骨水泥固化过程中发生化学反应产生二氧化碳气体，由此形成多孔碳酸化羟基磷灰石骨水泥;(3)通过化学成分、化学结构、力学强度、固化时间、孔隙率等检测，对其理化性能、可操作性能和组织相容性进行评估。［结果］所合成的碳酸化羟基磷灰石骨水泥原位固化性能好，固化时间为12～15 min，可操作性能强；化学成分分析发现，其固化产物中含有5.6％的碳酸根成分，与天然骨的矿物相类似；孔隙分析表明，材料的孔隙之间相互贯通，孔隙率为36％；力学测试结果显示，材料的抗压强度为4.3±2.6 MPa，相当于松质骨的力学强度；细胞毒性实验证明，该材料具有优秀的组织相容性。［结论］多孔碳酸化羟基磷灰石骨水泥的化学成分、理化性能、孔隙结构均与天然的松质骨相似，组织相容性良好，可作为无机植骨材料。
【关键词】 碳酸化羟基磷灰石； 骨水泥； 多孔； 原位固化
Porosity study of the carbonated hydroxyapatite cement∥TANG Pei-fu, YAO Qi, HUANG Peng，et al. Department of Othopaedics, General Hospital of Chinese People's Liberation Army, Beijing 100853, China
Abstract：［Objective］To compose carbonated hydroxyapatite cement with chemica l materials, and by adding the pore agent to develop a new bone substitute, which can be solidified in situ to form porous carbonated hydroxyapatite.［Method］(1)A new type of carbonated hydroxyapatite cement (CHC)was prepared. The powder of cement was composed of calcium carbonate, tricalcium phosphate and calcium phosphate dibasic. The liquids were prepared by 0.2mol/L sodium phosphate buffer, solide phase to liquid phase was 1g to 0.4 ml; (2)To prepare an in situ setting porous carbonated hydroxyapatite cement，add the pore agent into the powder of cement,pore generate CO2 during situ setting of cement; （３）The chemcial composition, chemcial constitution mechanical property, setting time ,interval porosity of the PCHA were tested. and then the physio-chemical character,manipulatity, histocompatibility were evaluated.［Result］Addition of pore agent could succeed to prepare a new bone substitute which could set in situ and transform into porous carbonated hydroxyapatite. The setting time was 13～15 minutes which was suitable to clinical application. The pore size and porosity character could be controlled by adjustment of the component. The checking results demonstrated that the self-setting composition of this cement was carbonated hydroxyapatite which was similar with the mineral phase of natural cancellous bone,the carbonic acid radical was 5.6％ in the solidify production. Contain of the porosity was 36% with interconnect pore, the compressive strength was 5.6±2.2 MPa which was equal to strength of cancellous bone, and the cytotoxicity tests showed an exellent biocompatibility.［Conclusion］The porous carbonated hydroxyapatite cement is a good bone substitute which seems to be the cancellous bone with good porosities, exellent biocompatibility.
Key words：carbonated hydroxyapatite; cement; porous; setting in situ
碳酸化羟基磷灰石骨水泥（carbonated hydroxyapatite cement, CHC）是一种新型的无机植骨材料。CHC固化产物的晶体结构中含有碳酸根，与天然骨的羟基磷灰石晶体结构类似，因此与磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）相比，CHC的体内降解速度加快，组织相容性更好［1］。然而，CHC缺乏天然骨的多孔结构，体内降解速度仍然较慢，与新骨生长速度并不匹配。开发一种能原位固化并形成多孔结构的CHC，将加速CHC的体内降解，赋予CHC更优秀的成骨潜能。本实验采用产气制孔的新方法，成功的制备出多孔碳酸化羟基磷灰石骨水泥（porous carbonated hydroxyapatite cement, PCHC）。通过系列检测证明PCHC理化性能稳定，组织相容性更好。
1 材料和方法
1.1 材料的合成
1.1.1 CHC的合成 以碳酸钙、磷酸氢钙等化学试剂为原材料，通过高温烧结（1 200℃）合成CHC粉体。将粉体超细研磨成1～5 μm的粉粒，包装、灭菌。再以磷酸氢二钠和磷酸二氢钠合成浓度为0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液，作为固化液，安培瓶密封、灭菌。粉体与固化液的混合比为1 g∶0.4 ml。
1.1.2 PCHC的合成 在CHC粉体中分别加入适量的成孔剂，采用气流冲击法混合均匀，干燥、真空包装。灭菌备用。
1.2 PCHC的理化性能检测
1.2.1 PCHC固化时间 参照ISO3107中关于磷酸锌水泥的测试方法，在37℃、100%湿度环境中进行测试，固液比为1.0∶0.4(g：ml)，测试5个样本，取平均值。
1.2.2 抗压强度 将PCHC固化液和干粉按固液比为1.0∶0.4(g：ml)混合，制成8 mm×12 mm的圆柱体，在37℃、100%湿度环境中进行固化，24 h后取出样本,在MTX858生物力学实验机(Systems,美国)上测试样本压缩强度，加载速度0.2 mm/min，测试5个样本,取平均值。
1.2.3 PCHC晶体结构 将PCHC置于37℃、100%湿度下4周，然后以丙酮浸泡1 h,真空干燥，傅立叶变换红外线(fourier transform infrared，FTIR)分析PCHC的化学结构。
1.2.4 PCHC成分分析 将PCHC置于37℃、100%湿度下4周，然后用丙酮浸泡1 h，真空干燥。采用X线衍射(X-ray differaction,XRD)分析仪测试化学成分，测试条件为CuKα衍射(λ=0.154 nm)，40 kV，150 mA。
1.3 PCHC的孔隙结构检测
1.3.1 孔隙率检测 取PCHC固化产物10 g，冷冻干燥后制成直径为0.2 mm的颗粒，采用AUTOPORE-9420型压汞仪(孔率仪器公司，韩国)测量孔隙率、孔径分布曲线和内比表面积。共测量5个样本，取平均值。
1.3.2 扫描电镜观察 取PCHC固化产物，真空干燥后浸入液氮中冷冻，低温下制造断裂面，再次干燥后表面喷金,电镜下直接观察孔形态、结构、孔径和孔的贯通性。
1.4 PCHC的组织相容性检测
1.4.1 浸提液的制备 取PCHC颗粒2 g，浸在pH＝7.5，含10％胎牛血清的DMEM培养液100 ml中10 d。
1.4.2 兔骨髓基质细胞的分离与培养 无菌条件下取兔骨髓血，常规DMEM培养液中扩增。3 d后细胞计数约3×108/ml，备用。
1.4.3 活细胞增殖率测定（MTT法） 常规收集兔骨髓基质细胞，消化计数后分成2组：PCHC组和空白对照组。每组复8孔，其中实验组的加100％浸出液，对照组加DMEM培养液。常规培养8 d，在免疫酶标仪上以500 nm波长测定吸收值（OD值），取平均数，通过下面的公式计算相对增值率（RGR），RGR＝（实验组吸光值／阴性对照组吸光值）×100％。
2 结 果
2.1 PCHC的理化性质
PCHC的固化时间为12～15 min，能满足临床操作要求。抗压强度为4.3±2.6 MPa，与人松质骨强度相当。XRD分析PCHC的矿物相为低结晶结构，与人松质骨相似。FTIR检测显示，PCHC的固化产物为碳羟基磷灰石，晶格相中含5.6%碳酸根，与人骨4%～6%的碳酸根含量相吻合。
2.2 PCHC的多孔结构 PCHC的孔隙率为36％，158～394 μm之间的孔隙分布占所有孔隙的46.61％，259 μm的孔径分布最高（图1）。低倍扫描电镜发现，PCHC的孔径在100～400 μm之间分布最多，大部分孔与孔之间有100 μm左右小孔贯通（图2）；高倍下观察孔壁，可见孔壁是由3 μm左右细小颗粒通过瓶颈结构互相连接，伴随3～10 μm的微孔结构。
2.3 组织相容性
MTT法检测PCHC的细胞相对增值率（RGR）结果与空白对照组没有差别。说明PCHC对骨髓基质细胞无细胞毒性作用。图3示细胞培养3 d的扫描电镜结果：大量的细胞贴壁生长，细胞呈不规则的球形、梭形或多角形，从胞体伸出的伪足长短不一，有的与其他胞体相连，有的伸向孔之间的通道内，实验组PCHC和对照组的细胞形态无差别。
3 讨 论
1995年Constanz等［1］成功地将碳酸根加入HA的晶格相中，率先报道了碳酸化羟基磷灰石骨水泥（CHC）的研究成果，在材料界引起了巨大轰动，有人甚至称之为具有“革命进展性”的新材料。与磷酸钙骨水泥（CPC）相比，CHC不但具有原位固化、随意塑型、可降解、组织相容性好、无疾病传播等所有优点，而且CHC的晶格相中约4％～6％的碳酸根取代了硫酸根的位置。这种取代导致羟基磷灰石晶格内存在缺陷，整个晶体尺寸变小，结晶度降低，溶解度相应增加，因而有利于材料的降解［2］。有研究表明，碳酸根的存在可以使羟基磷灰石的溶解度提高7倍［3］。本实验合成的PCHC通过XRD和FTIR分析，证明其固化产物为碳羟基磷灰石，晶格相中含有5.6％的碳酸根，与天然骨碳羟基磷灰石晶体结构中4～6％的碳酸根含量相吻合。
理想的骨缺损修复材料，应当富有合适的孔隙率和适当的孔径。孔隙之间应当互相连通，从而更好的发挥骨诱导和骨传导作用。多孔结构一方面能为骨生长因子、成骨细胞等生物活性物质提供几何空间,另一方面,有利于体液在材料内部流动,与体循环连通,增加材料与体液的接触面积,加速材料的降解过程。文献报道，骨生长、矿化的最适孔径为
图1 PCHC的孔径－孔隙率百分比（％）曲线 图2 PCHC扫描电镜观察，多孔结构与松质骨相似。黑色为孔隙，灰色为孔壁。SE×4０
图3 扫描电镜。PCHC与兔骨髓基质细胞共培养第3 d，细胞贴壁生长活跃。SE×１７０
100～400 ms［４，５］。PCHC的孔隙率为36％，其中158～394 μm之间的孔隙分布占所有孔隙的46.61％，259 μm的孔径分布最高（图1）。低倍扫描电镜发现，PCHC的孔径在100～400 μm之间分布最多，大部分孔与孔之间有100 μm左右小孔贯通（图2）；高倍下观察孔壁，可见孔壁是由3 μm左右细小颗粒通过瓶颈结构互相连接，伴随3～10 μm的微孔结构。由此可见，PCHC固化后形成的孔隙结构符合骨生长要求。
PCHC独特的成孔技术，使其在原位固化的同时形成多孔结构。生物材料的常见成孔技术是浸渍法和有机质填充法。前者是将易溶解物质与生物材料混合浸渍，易溶物首先溶解留下空间成孔。后者是将有机质与生物材料混合后，通过高温烧结去除有机质形成多孔结构。上述成孔技术均为预制成型成孔法，其共同特点是先将成孔剂与基质材料均匀混合，然后制成一定形状的固体块，再通过高温、溶解等方法，除去成孔剂，因而制成了多孔材料。这些材料的优点是所形成的孔隙结构均匀，大小一致。缺点是盲孔太多，孔之间的连通性欠佳，材料不能随意塑型，不能与宿主骨密切贴合，容易被体液冲刷流失，而且降解速度非常缓慢［6］。如果将这些方法应用于CHC，必然使该材料丧失其原位固化的突出优点。本实验采用发泡剂成孔技术，制成了PCHC。PCHC在原位固化的同时产生气体，形成多孔结构，从而避免了预制成型制备多孔材料的缺点，保留了CHC骨水泥原位固化性能等所有的优点。经过系列检测证明，PCHC固化产物与人骨矿物相相同；多孔结构与松质骨相似，孔隙率为36％，孔之间互相贯通；固化时间为12～15 min，能满足临床应用；抗压强度为4.3±2.6 MPa，与松质骨强度相当；细胞毒性检测，组织相容性良好。
【参考文献】
［1］ Constanz BR, Ison IC, Fulmer MT, et al．Skeletal repair by in situ formation of the mineral phase of bone［J］． Science， 1995，267: 1796-1799.
［2］ 郝立波，毛克亚，王继芳,等.碳酸化磷灰石与骨界面结合强度的生物力学特性研究［J］.中国临床康复，2004，8（20）：3978-3980.
［3］ 高月侠，冉均国，苟 立，等.生物活性羟基磷灰石陶瓷［J］.稀有金属材料与工程，2002，31：315-317.
［4］ Bong SC, Choon KL, Kug SH. Osteocoduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations［J］．Biomaterials， 2000， 21:1291-1298.
［5］ Tadic D, Beckmann F, Schwarz F. A novel method to hydroxyapatite objects with interconnecting porosity that avoids sintering［J］． Biomaterials， 2004， 25:3335-3340.
［6］ Ooms EM, Wolke GC. Trabecular bone response to injectable calcium phosphate (Ca-P)cement［J］．J Biomed Mater Res, 2002, 61:8-18.
作者单位：解放军总医院骨科， 北京复兴路 100853