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【摘要】 ［目的］探讨人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1,hIGF-1)基因在退变椎间盘中的表达及对椎间盘中Ⅱ型胶原表达的影响。［方法］参考文献〔1〕制备出腰椎间盘退变（intervertebral disk degeneration,IVDD)动物模型24只，随机分为携带hIGF-1基因重组腺病毒（Ad/CMV-hIGF-1)、hIGF-1生长因子及PBS组。L4、5、L5、6椎间盘中分别注射25 μl第2代Ad/CMV-hIGF-1(8×108 PFU)、hIGF-1生长因子（100 μg/L)、PBS。注射后1、2、4、8周，Western blot检测hIGF-1蛋白表达；半定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。［结果］hIGF-1蛋白带出现在7 540.00 u。Ad/CMV-hIGF-1组hIGF-1蛋白表达持续达4周以上，hIGF-1组表达持续约2周；PBS注射组无hIGF-1蛋白表达。Ⅱ型胶原电泳条带出现在200～300 bp；在注射后1～4周，Ad/CMV-hIGF-1组内Ⅱ型胶原mRNA相对表达量进行性增加，8周轻度下降，4个时期比较（F=12.18，P＜0.001)；注射后1～8周，hIGF-1注射组、PBS注射组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量进行性下降（F=27.38、21.56，P＜0.001)。相同时间点3组比较，Ⅱ型胶原mRNA相对表达量Ad/CMV-hIGF-1组最高，PBS组最低（F=27.31～39.85，P＜0.001）。［结论］hIGF-1基因在退变椎间盘中的表达能够促进合成Ⅱ型胶原。
【关键词】 椎间盘； 退变；表达； hIGF-1
Role of human insulin-like growth factor-1 gene on collagen type Ⅱ expression of degenerative intervertebral disk∥HUANG Zong-qiang,LIU Shang-li,ZHENG Zhao-min.Department of Orthopaedics,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China
Abstract［Objective］To study the role of hIGF-1 gene on collagen type Ⅱ expression of degenerative intervertebral disk.［Method］Twenty-four male New-Zealand rabbits intervertebral disk degenerontion (IVDD) models were done according to reference and randomly divided into Ad-CMV-hIGF-1,hIGF-1 growth factor and PBS group.Twenty five microlitre the second generation Ad/CMV-hIGF-1(T=80×109 PFU/L),hIGF-1 growth factor(100 μg/L)and PBS were respectively injected into L4、5,L5、6 intervertebral disk under fluoroscopic guidance.One,two,four and eight weeks post-operation,rabbits were sacrificed,intervertebral disk samples were harvested.Total proteins of equal mass intervertebral disks were extracted,isolated in SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and transferred to polyvinylidene difluoride(PVDF)Millipore.The hIGF-1 growth factor expression were indentified with Western blot.Collagen type Ⅱ gene fragments were amplified with RT-PCR,and relative expression was done with GAPDH as intern control.［Result］The hIGF-1 interest protein existed at 7.6 Kilo-Dalton.At one week after injection,its expression quantities were almost equal between Ad/CMV-hIGF-1 and hIGF-1 growth factor group.At two week after injection,it obviously declined in hIGF-1 growth factor group.At four week after injection,it still expressed in Ad/CMV-hIGF-1 group.At eight week after injection,it did not express in theree groups.Collagen type Ⅱ mRNA relative expressions increased significantly from one to four weeks after injection,declined slightly at the end of eight weeks in Ad/CMV-hIGF-1 group.However,they appeared to decrease continuously in the other two groups with time.At the corresponding phases,those in PBS group were the lowest.［Conclusion］Ad/CMV-hIGF-1 could successfully infect degenerative intervertebral disk.The hIGF-1gene expression could last four weeks and could stimulate collagen type Ⅱ synthesis in Ad/CMV-hIGF-1 group.
Key words：intervertebral disk; degeneration; expression; insulin-like growth factor-1
椎间盘退变（intervertebral disk degeneration,IVDD）的确切分子生物学机制尚不明确。多数学者认为IVDD为多因素协同作用的结果，与椎间盘中细胞营养下降、力学及遗传等因素有关，但细胞因子减少及致炎因子增多等分子生物学改变在发病中起主要作用〔2〕。1991年，Thompson等〔3〕检测了多种细胞因子能够促进犬椎间盘细胞分泌细胞外基质，开始了生长因子应用于椎间盘的体外实验研究，而后相继出现了多篇文献报道〔4〕。但椎间盘细胞的体外培养条件与体内椎间盘细胞所处的内环境有明显差异：生长因子维持作用短暂；发挥作用需要多次或者连续给药，造成给药途径引发感染等；另外生长因子的费用亦不菲。转基因技术的发展为解决生长因子持续作用于椎间盘带来便捷之道。Nishida等〔5〕以腺病毒为载体，将Lac Z基因、TGF-β1基因转染到正常成年兔椎间盘获得成功。但与正常椎间盘有明显区别的是，椎间盘发生退变后，其细胞数量减少功能不活跃，在生物学特性方面与正常细胞存在明显差异。退变的椎间盘细胞在椎间盘退变的生物学环境中能否被转染仍是未知。即便能够转染，转染后基因表达水平如何，能否起到修复IVDD的作用，均需进一步研究。本研究将自行构建的Ad/CMV-hIGF-1载体〔6〕直接注入新西兰大白兔IVDD模型〔1〕，观察hIGF-1表达水平及表达后对退变椎间盘细胞合成Ⅱ型胶原的影响，旨在通过体内实验，为IVDD的基因治疗提供直接实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料、仪器及设备
TRIzol试剂（GIBCO BRL，美国）；DEPC、PCR引物及Tween 20（上海生物工程有限公司，中国）；RNA酶抑制剂（华美公司，中国）；蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad公司，美国）；鼠抗人IGF-I单克隆抗体（R&D Systems Inc,美国）；辣根过氧化物酶结合的抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology,英国）；预染蛋白质分子量Marker(New England BioLabs Inc,英国）；PVDF膜（Millipore,美国）；丙烯酰胺，抑蛋白酶肽，苯甲基磺酰氟及N’，N’-亚甲双丙烯酰胺（Amresco,美国）；N’，N，N’，N’-四甲基乙二胺（Sigma,美国）；DNA Marker及RT-PCR试剂盒（Takara公司，中国）；PCR仪（PE公司，美国）；Hettich 32R台式低温高速离心机（Heraeus,德国）；台式常温高速离心机（Eppendorf 5415c,德国）；恒压恒流水平电泳仪及垂直电泳电转移槽（Bio-Rad，美国）；-80 ℃低温冰箱，立式大型水平离心机及Biofuge 22R台式低温离心机（Heraeus,德国）;凝胶摄像系统（Polaroid,美国）；XW-80漩涡振荡器及振动摇床（上海跃进医疗器械厂，中国）。
1.2 动物实验
1.2.1 hIGF-1生长因子、第2代Ad/CMV-hIGF-1载体溶液的配制
将hIGF-1生长因子用PBS溶液稀释，分装入EP管中，每管2.5×10-3 μg，-70 ℃保持，使用前加PBS至25 μl，每个椎间盘注入的剂量为2.5×10-3 μg。参考文献〔7〕合成的第2代Ad/CMV-hIGF-1载体稀释到每25 μl含有2×106 PFU。每个椎间盘注入的腺病毒总量为2×106 PFU。
1.2.2 腰IVDD动物模型制备、给药及标本制备
参考文献〔1〕制备出腰IVDD动物模型24只，随机分为Ad/CMV-hIGF-1、hIGF-1生长因子及PBS组，每组有新西兰大白兔8只。实验动物用氯氨酮针35～50 mg/kg、氯丙嗪针10～25 mg/kg联合肌肉注射，动物麻醉成功后，右侧卧位于手术台（本研究组设计定做）。在X线透视下，用硬脊膜穿刺针穿刺L4、5、L5、6椎间盘，穿刺成功后，拔出硬脊膜穿刺针内塞，放入腰麻针。用100 μl微量移液器依动物分组各注射携带hIGF-1基因的腺病毒载体（滴度为80×109 PFU/L）、hIGF-1生长因子（100 μg/L)、PBS，注入容量为25 μl。分别于注射后1、2、4、8周，各组实验动物均取2只，动物麻醉后，穿刺耳缘静脉注入10 ml空气致死。迅速切取腰椎全段，切除椎板及附着肌肉，分别切取L4、5、L5、6椎间盘，去除上下软骨终板，仅保留完整的纤维环、髓核组织。
1.2.3 Western blot检测hIGF-1蛋白表达
1.2.3.1 组织总蛋白质提取及浓度测定
（1）组织剪碎：于0 ℃以PBS充分洗涤组织碎片，4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，估算离心管底部沉淀物体积；吸出上清液。（2）以5倍体积预冷的悬浮缓冲液分散组织碎片，尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液。（3）将样品置于沸水浴中加热10 min，采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切。（4）于室温以10 000r/min将样品离心10 min，将上清液移于另一管中，弃去沉淀物。（5）按Bio-Rad蛋白质检测试剂盒说明检测样品蛋白浓度。
1.2.3.2 Western blot检测hIGF-1蛋白表达
（1）制备SDS聚丙烯酰胺分离胶（8 ml)、12%的SDS聚丙烯酰胺浓缩胶（3 ml)。（2）加样：每样本各取总蛋白50 μg,加等体积2×SDS上样缓冲液（约10 μl），混匀，另一管加预染蛋白Marker(用于考马斯亮蓝染色）或辣根过氧化物酶结合的生物素化蛋白Marker(用于Western-blot)20 μl，瞬时离心使溶液沉于管底，标本和蛋白Marker均于沸水中煮沸3～5 min，按顺序用微量加样品将每管样本中的全部溶液或蛋白Marker加入样品孔中。（3）电泳：于120 V恒压条件下电泳，当溴芬蓝染料进入分离胶后，电泳条件改为恒压220 V，继续电泳直至染料达到胶底。（4）考马斯亮蓝染色：取出电泳玻板，小心取出凝胶，将凝胶放入一培养皿中，倒入0.25%考马斯亮蓝染色液，放在摇动的脱色摇床上于室温染色40 min。然后倒出并回收染色液，加入脱色液，平缓摇动，直到出现明显的蓝色的蛋白条带。（5）半干式电印迹转膜，Western blot检测hIGF-1生长因子表达：用封闭液封闭PVDF膜；用0.1 mol/L PBST洗涤PVDF膜5 min×1次；用一抗孵育PVDF膜，4 ℃过夜；用0.1 mol/L PBST振荡洗涤PVDF膜5 min×2次;37 ℃用1∶200二抗孵育PVDF膜1 h；用0.1 mol/L PBST振荡洗涤PVDF膜5 min×4次；DAB显色。
1.2.4 半定量RT-PCR监测Ⅱ型胶原mRNA的表达
参照文献〔8〕半定量RT-PCR监测Ⅱ型胶原mRNA的表达。
2 结 果
2.1 hIGF-1基因在椎间盘中的表达
注射后1、2、4及8周，SDS-PAGE显示3组实验动物的椎间盘组织均有不同分子量的蛋白条带，肉眼观察在蛋白表达量上无明显差异。Western blot显示hIGF-1目的蛋白带出现在7.54×103 u，与理论值相符（图1）。注射后1周，Ad/CMV-hIGF-1注射组、hIGF-1注射组均出现hIGF-1蛋白带，其表达量大致相同，PBS注射组无目的蛋白带出现（图2）；注射后2周，Ad/CMV-hIGF-1注射组、hIGF-1注射组仍出现hIGF-1蛋白带，但hIGF-1注射组表达量明显下降；注射后4周，Ad/CMV-hIGF-1注射组出现hIGF-1蛋白带，但表达量已经开始下降，hIGF-1注射组未出现hIGF-1蛋白带（图3）；注射后8周，3组实验动物的椎间盘组织均未出现hIGF-1蛋白带。
图1注射后不同时期，Ad/CMV-hIGF-1组hIGF-1表达的Western blot鉴定 M：蛋白marker;Lane 1:注射后1周；Lane 2:注射后2周；Lane 3:注射后4周；Lane:注射后8周
图2注射后1周，3组hIGF-1表达Western blot鉴定 M:蛋白marker;Lane 1:Ad-CMV-hIGF-1组；Lane 2:hIGF-1生长因子组；Lane 3:PBS组 图3注射后4周，3组hIGF-1表达的Western blot鉴定 M：蛋白marker;Lane 1:Ad/CMV-hIGF-1组；Lane 2:hIGF-1生长因子组；Lane 3:PBS组
2.2 转hIGF-1基因对Ⅱ型胶原的影响
Ⅱ型胶原和GAPDH分别出现在200～300 bp、500～600 bp处，与引物设计预想得到的片段相同；在注射后1～4周，Ad/CMV-hIGF-1组内Ⅱ型胶原mRNA相对表达量进行性增加，8周显著下降，4个时期总的比较有统计学差异（F=12.18，P＜0.05),注射后4周和8周相比，有统计学差异（P＜0.05）；注射后1～8周，hIGF-1注射组、PBS注射组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量进行性下降，组内4个时期相比，有统计学差异（P＜0.05），hIGF-1注射组注射后4周和8周相比，无统计学差异（P＞0.05）；相同时间内，PBS组的表达量最低（表1）。表1不同处理因素不同时期Ⅱ型胶原mRNA相对表达量（略）
3 讨 论
3.1 hIGF-1目的基因在兔椎间盘中的表达
Western blot是检测目的基因在组织中表达的较常用且最灵敏的方法。本研究采用Western blot手段检测注射到兔椎间盘中的hIGF-1生长因子等的表达，发现术后1周，2组中均有hIGF-1目的蛋白的表达，且表达量基本相同；术后2周，在2组中仍能检测到hIGF-1的表达，但生长因子组表达量明显下降；术后4周，仅能在hIGF-1目的基因组检测到hIGF-1的表达，但生长因子组表达量明显下降。PBS组无hIGF-1的表达。实验结果表明：hIGF-1目的基因在兔椎间盘中的表达至少持续4周以上，而hIGF-1生长因子在兔椎间盘中存在仅2周左右。hIGF-1生长因子持续时间较短可能与生长因子的半衰期有关。
Nishida等〔9〕将Lac Z标志基因直接注射兔椎间盘，结果显示标志基因的表达至少持续12周左右。Paul等〔10〕将Sox 9基因用腺病毒携带直接注射兔椎间盘，发现其表达持续5周以上。季爱玉等〔11〕研究发现hIGF-β1基因表达对椎间盘蛋白多糖的影响持续达12周左右。本研究目的基因的表达与文献报道存在差异，原因可能如下：（1）实验动物不同，本实验采用兔椎间盘退变模型，而文献中采用正常的新西兰大白兔，正常和退变的新西兰大白兔椎间盘内环境可能存在极大的差异；（2）腺病毒的纯度存在差异，本研究由于实验室无低温超速离心机，故对实验所用的腺病毒未进行纯化处理，文献中可能采用的腺病毒纯度较高；（3）实验检测手段差异；（4）腺病毒滴度差异。Paul等采用的病毒滴度为1×109 PFU。季爱玉等采用的为6×106 PFU。本研究采用的病毒滴度为2×106 PFU。
3.2 hIGF-1基因表达对兔椎间盘Ⅱ型胶原的影响
Ⅱ型胶原是兔椎间盘主要细胞外基质，对稳定椎间盘细胞内环境至关重要。生长因子促细胞增殖作用被认为与浓度有关，有量-效关系，存在最佳浓度，100 μg/L hIGF-1为刺激髓核细胞合成PG的最适浓度〔12〕。本研究采用该剂量的hIGF-1生长因子直接注射兔椎间盘，结果显示Ⅱ型胶原mRNA相对表达在注射后1～8周表达量持续下降，各时间点数值比较存在统计学差异（P＜0.05）。说明hIGF-1生长因子刺激兔椎间盘细胞合成Ⅱ型胶原的作用可能被兔持续存在的椎体间失稳导致的椎间盘继续退变所抵消。
1998年，Nishida等〔9〕用腺病毒将外源基因带入实验动物的椎间盘，相继出现几篇关于IVDD基因治疗的报道〔4〕。本研究结果显示腺病毒载体能够将有治疗作用的hIGF-1基因带入退变的椎间盘，hIGF-1基因的表达具有时效性，但促进兔椎间盘分泌Ⅱ型胶原的作用弱于文献报道〔5〕，其原因可能与多种因素有关。首先，采用的实验动物模型仍然存在椎间失稳，在接受转基因治疗同时，仍承受着椎间失稳影响，椎间盘内发生着修复与破坏的交互作用。椎间失稳势必影响IVDD基因治疗效果。其次，本研究采用IVDD的新西兰大白兔动物模型，其软骨终板已经发生了明显变化。软骨终板是椎间盘营养通路，软骨终板钙化必然会引起椎间盘营养代谢障碍，并妨碍椎间盘修复活动〔1〕。再者，从转染效应可见，Ⅱ型胶原mRNA相对表达量虽然有所增加，但增加幅度不明显，显示转染生长因子的修复效应与退变椎间盘的修复要求可能还有相当距离。
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作者单位：郑州大学第一附属医院骨科，郑州 450052