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【摘要】 ［目的］探讨Cathepsin L与人腰椎间盘退变的关系。［方法］实验组标本来源于腰间盘突出症的患者，在外科手术过程中取得的退变间盘组织，并根据术中所见将腰间盘突出分为非包含型组和包含型组；对照组间盘来源于胸腰段骨折行前路手术患者手术中切除的间盘组织，以上标本采用HE染色组织学观察椎间盘的退变特征，免疫组织化学S-P法和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测人腰椎间盘细胞Cathepsin L蛋白表达。［结果］HE染色组织学观察在退变组间盘中，各标本均表现出一定的退变特征：纤维环板层结构紊乱，软骨细胞巢状增生，纤维环粘液瘤样变，髓核软骨细胞减少，纤维细胞增生，玻璃样变及纤维化，髓核毛细血管的侵入，炎性细胞的浸润等。在未包含型组与包含型组比较显示了更多的髓核毛细血管侵入和炎性细胞浸润，髓核及纤维环退变更严重，纤维细胞增生及瘢痕形成。免疫组织化学染色显示组织蛋白酶L阳性率在退变组(90.68±7.61)%明显高于对照组(10.00±8.69)%，并且在非包含型组(95.45±4.63)%明显高于包含型组(86.93±7.49)%。RT-PCR结果显示组织蛋白酶L的mRNA表达水平在退变组(1.445±0.206)%较对照组(0.526±0.378)%明显上调，并且在非包含型组(1.608±0.044)%明显高于包含型组(1.282±0.166)%。以上结果均经统计分析证实组间差异有统计学意义。［结论］Cathepsin L与人腰椎间盘退变有关。
【关键词】 椎间盘； 退变； 组织蛋白酶
Involvement of cathepsin L in the pathomechanism of lumbar intervertebral disc degeneration.∥ZHI Chun-sheng,XIE Lin.Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital,Shenyang 110044,China.
Abstract［Objective］To determine the involvement of cathepsin L in the pathomechanism of lumbar intervertebral disc degeneration.［Method］Experimentalgroup were made from 25 cases with lumbar disc protrusion disease and control group were made from 5 cases of thoracic-lumber broken. The thirty disc specimens collected at the time of surgery were classified into degenerated group and control group, and the degenerated group were further classified into contained discs and noncontained discs depending on the findings of operation. Paraffin-embedded sections of all intervertebral disc tissue were stained by Hematoxylin and Erosin, and then immunohistochemically stained with monoclonal antibodies for Cathepsin L. Furthermore, mRNA of cathepsin L from all the specimens was detected by RT-PCR.［Result］Hematoxylin and eosin staining revealed obvious signs of degenerationcharacterized by disorganization of the oriented lamellar structure of the anulus fibrosus, formation of fissures, cystic or myxomatous change, cloning of chondrocyte-like cells, cartilaginous metaplasia of the anulus, vascular invasion in outer anulus. Cathepsin L was immunolocalized in disc cells at various sites exhibiting degeneration. And Cathepsin L-positive cell ratio observed in degenerated group (90.68±7.61)%was significantly higher than that in control group (10.00±8.69) %and in noncontained group lumbar intervertebral discs (95.45 ±4.63) %was higher than that incontained discs (86.93±7.49)%.Furthermore, mRNA of cathepsin L was up regulated in degenerated disc tissue (1.445±0.206)% compared to the control disc tissue (0.526±0.378)% detected by RT-PCR , and also was higher in noncontained discs (1.608±0.044)% than the contained discs(1.282±0.166)%. ［Conclusion］Cathepsin L is involved in the pathomechanism of lumbarintervertebral disc degeneration.
Key words：intervertebral disc; degeneration; cathepsins
人类椎间盘退变开始很早，并且是引起后背痛和神经并发症的最主要的原因。但关于椎间盘退变的病理过程我们还知之甚少。
最近研究表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用。除基质金属蛋白酶(ＭＭＰs)外，组织蛋白酶(Cathepsins)也是能够降解胶原和粘蛋白的蛋白水解酶。已有研究表明Cathepsins在骨性关节炎和类风湿关节炎的关节软骨的破坏过程中起作用，然而，关于Cathepsins在椎间盘退变中的作用的研究还较少。本次试验采用免疫组织化学S-P法和RT-PCR法检测人腰椎间盘细胞Cathepsin L蛋白表达，研究Cathepsin L与人腰椎间盘退变的关系。
1材料与方法
1.1标本实验所用间盘取自术中，退变组25例(腰椎间盘突出症患者,男11例，女14例；年龄23～68岁)。并根据术中所见将腰间盘突出分为非包含型组(11例)和包含型组(14例)。对照组间盘5例（胸腰段骨折行前路手术患者，取手术中切除的间盘组织，并经MRI T2加权间盘信号改变程度验证其为正常间盘，男3例，女2例；年龄21～32岁）。
1.2主要试剂：兔抗人Cathepsin L单克隆抗体由武汉博士德生物技术有限公司提供。RT-PCR试剂盒(Ver 1.1)由大连宝生物工程有限公司提供。
1.3实验方法：
1.3.1免疫组织化学Ｓ－Ｐ法检测椎间盘细胞Cathepsin L的蛋白表达具体操作步骤按免疫组化试剂盒说明进行。
1.3.2计数Cathepsin L阳性染色率：Cathepsin L阳性染色定位于细胞浆，呈黄棕色颗粒。每张切片随机选取5个高倍视野，计数阳性细胞百分比，着色细胞<20％设定为－～±；20～60％为＋；>60％为＋＋。
1.3.3 ＲＴ－ＰＣＲ检测Cathepsin L基因mRNA转录水平。
1.3.3.1提取总RNA具体步骤按RNAout使用手册进行。
1.3.3.2逆转录反应：按以下条件进行６５℃ １ min→30℃ 5 min→15-30 min内匀速升温至６５℃→９８℃ ５ min→５℃ 5 min。
1.3.3.3ＰＣＲ（cathepsin L）:取cDNA 3 μl，按下列条件进行ＰＣＲ反应： 94℃ ３ min→②84℃ ４5 s→③56.7℃ 1 min→④72℃ 1 min→⑤72 ℃ 7 min②-④循环35次。
引物序列：Cathepsin L上游：5′-CAA CCA AGG CTT TGA GAT-3′下游：5′-TCC AAG GGA GTG TTC AGG-3′共366bp。β－actin上游：5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3′下游：：5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′共498bp。
1.3.3.4 ＰＣＲ产物电泳和半定量分析：取ＰＣＲ反应产物８ μl，加2 μl上样缓冲液，于2％琼脂凝胶电泳，Ｋodak电泳凝胶图像分析系统下观察、摄像及扫描分析。以CatepsinL基因条带的吸光度容积与β－actin条带的吸光度容积的比值作为目的基因的mRNA的相对含量。
1.4统计分析利用ＳＰＳＳ 10.0 Ｆor Windows统计软件进行统计分析，比较两组样本Cathepsin L基因mRNA转录水平差异是否有统计学意义。
２结果
2.1ＨＥ染色显示：在对照组间盘中（图1），纤维环仍保持着致密的板层结构，细胞成分较多，呈梭形纤维细胞样或呈软骨细胞样。
在退变组间盘中（图2），各标本均表现出一定的退变特征：纤维环板层结构紊乱，软骨细胞巢状增生，纤维环粘液样退变，纤维环裂隙形成等。髓核软骨细胞减少，纤维细胞增生，组织坏死，玻璃样变及纤维化，髓核毛细血管的侵入，炎性细胞的浸润等。
2.2 免疫组化染色显示：在对照组间盘中，Cathepsin L阳性细胞率低（图3）；在退变间盘中Cathepsin L阳性率较高（图4）。
在退变组比对照组有较高的Cathepsin L阳性细胞率(表1)，x2检验分析证实组间差异有统计学意义（Ｐ＜0.05）。表1椎间盘退变组和对照组间Cathepsin L阳性细胞率比较（略） 表2椎间盘退变非包含型组和包含型组间Cathepsin L阳性细胞率比较（略） 表3Cathepsin L基因mRNA在退变组和对照组转录水平比较（略） 表4Cathepsin L基因mRNA在非包含型组和包含型（略） 在非包含型组比包含型组有较高的Cathepsin L阳性细胞率(表2)，x2检验分析证实组间差异有统计学意义（Ｐ＜0.01）。
2.3 ＲＴ－ＰＣＲ结果（图5）显示：Cathepsin L基因mRNA转录水平在对照组中均较低，退变组中均有较强表达。
退变组Cathepsin L基因mRNA转录水平高于对照组。t检验分析（表3）证实两组间差异有统计学意义（P<0.01）。
非包含型组Cathepsin L基因mRNA转录水平高于包含型组，t检验分析（表4）证实组间差异有统计学意义(P<0.01)。
3 讨论
椎间盘退变已被公认为是引起脊柱退行性变的主要原因,但引起椎间盘退变的机理目前仍不清楚。
最近的研究结果表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用。椎间盘细胞外基质由Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅸ，Ⅹ和Ⅺ型胶原和粘蛋白包括蛋白聚糖、二聚糖和核心蛋白多糖组成。这些细胞外基质蛋白能够被一些蛋白水解酶降解。有研究表明Cathepsins在骨性关节炎和类风湿关节炎所致的关节软骨的破坏过程中起作用。关节软骨的化学组成、结构及生物学特性与椎间盘非常类似，因此推想Cathepsins也可能在椎间盘退变的病理过程中发挥作用。
图1 对照椎间盘标本HE染色示纤维环仍保持着致密的板层结构(400×)； 图2 退变椎间盘标本HE染色示纤维环裂隙形成及粘液样变性(400×)； 图３ 对照组椎间盘标本免疫组化染色示Cathepsin L多数阴性(400×)； 图４ 退变组椎间盘标本免疫组化染色示Cathepsin L多数阳性(400×)； 图5 RT-PCR示CAT L基因mRNA转录水平在对照组中均较低，退变组中均有较强表达（图中黑色序号为退变组，蓝色序号为对照组）
组织蛋白酶（Cathepsins）是一大类裂解肽键的蛋白水解酶，因其催化中心不同而分为半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白水解酶，为一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，其分子量为30KD，由定位于9q21-22基因编码而来，在正常情况下CATL被膜包裹，参与机体的自身免疫系统反应；还在骨基质的降解过程中发挥重要作用〔1〕。但在病理状态下，各种原因所致的细胞损伤，导致溶酶体膜稳定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CATL释放到胞浆或组织间隙，并被激活，介导细胞炎性坏死及凋亡的发生。有研究表明CATL可以加快恶性肿瘤的侵袭与转移〔2〕，还能降解骨胶原促进骨钙溶解进入血液而造成骨质疏松〔3〕。
至今为止，关于参与间盘退变的蛋白水解酶尚仅限于ＭＭＰs，特别是基质降解酶。在本实验中，多数退变腰椎间盘中CATL表达阳性率高，且退变组间盘CATL基因mRNA转录水平比对照组间盘高，为证明CATL参与间盘退变提供了直接证据。
在椎间盘退变非包含型组与包含型组之间亦分别从免疫组化和RT-PCR两方面进行比较并进行统计分析证实，非包含型组CATL含量较包含型组明显增高，这些CATL可能与侵入椎间盘内的血管有关，因为在本实验中发现在非包含型组较包含型组有较多的毛细血管入侵现象，血源的细胞因子可能调节着CATL的产生，还需要进一步的实验证实。
CATL和MMPs间一个显著差别是它们的最适pH值不同。MMPs近中性，而CATL则为偏酸性。椎间盘是人体内最大的无血运组织，其内有大量的细胞外基质包裹着高度分化的椎间盘细胞，细胞分裂极不活跃，被动扩散营养方式使椎间盘的中央区营养差，并伴有低氧损伤。无氧代谢产生的乳酸造成内部的低pH环境，体内试验证实退变间盘内的pH值介于5.7～6.3。这不仅损害了细胞的新陈代谢，影响细胞的生物合成功能，还为CATL发挥细胞外蛋白水解酶作用、降解细胞外基质提供了适宜条件。
在扩张型心肌病的研究中发现：当心肌中CATL活性形式增加时，通过坏死和凋亡引起大量心肌细胞死亡后，心室进行重塑，最后导致扩张型心肌病。在椎间盘的增龄性改变中发生的凋亡过程可能也有CATL的参与。
间盘退变的实质是椎间盘细胞外基质的改变及基质与细胞粘附功能减退导致的细胞凋亡。细胞凋亡是椎间盘组织中活性细胞减少的一个主要因素，椎间盘内有两种类型的细胞：存在于髓核的脊索细胞和主要存在于纤维环和移行区的纤维软骨样细胞，它们通过合成、分泌细胞外大分子基质来维持椎间盘的正常生理功能，活性细胞减少或代谢异常时，不仅合成胞外基质的能力下降，而且合成产物多为小分子聚合体，不能有效维持椎间盘基质的胶体渗透压，从而导致椎间盘脱水及退变。
在扩张型心肌病的实验中还发现：应用组织蛋白酶抑制剂能够抑制CATL的生成及其活性，减少心肌细胞的坏死和凋亡，对心肌具有明显的保护作用〔4〕。贺茂林等〔5〕 研究发现：应用反义CATL基因转染骨肉瘤细胞，能使CATL的分泌水平下降, 细胞的体外侵袭力降低。这些研究为作者提供了抑制CATL的生成和活性的方法，但这是否能延缓或阻止间盘的退变还有待于进一步的研究。
吕浩然等〔6〕在分子水平证实了动物椎间盘退变模型与人类的相似性,在人类腰椎间盘退变中明显上调的基因，在退变动物模型椎间盘中被发现同样上调,这为作者进一步的应用动物模型来研究CATL在间盘退变过程中的作用机制奠定了基础。
尽管作者的结果表明在椎间盘退变过程中有CATL的表达上调，然而关于CATL的调节机制尚不清楚。据报告炎性细胞因子和生长因子是CATL成的调节因子。在椎间盘退变处，实际的基质降解蛋白水解酶的调节因子还有待于进一步阐明。总而言之，在人椎间盘退变组织中发现有CATL。这个发现将为蛋白水解酶参与人类脊柱退行性变的病理过程提供了直接的证据。更进一步地说，这将要求作者应用生物化学方法研究蛋白酶抑制剂或是基因疗法来治疗由Cathepsins和MMPs所引起的人类椎间盘的老化和退变问题。
综上所述，CATL参与了人腰椎间盘退变的病理过程，但是其作用机制还有待于进一步研究，另外CATL的调节机制尚不清楚。并且在本次实验中的部分对照间盘中CATL的表达也提示了CATL在参与间盘退变的病理改变时可能还具有其他的生物活性。
【参考文献】
〔1〕 Berdowska I, Cysteine proteases as disease markers\[J\].Clin Chim Acta.2004,342:41-69.
〔2〕 Arora S, Chauhan SS. Indentification and characterization of a novel human cathepsin L splice variant \[J\].Gene.2002,293:123-131.
〔3〕 Katunuma N,Tsuge H,Nukatsuka M,et al.Structure-based design of specific cathepsin inhibitors and their application to protection of bone metastases of cancer cells［J］.Arch Biochem Biophys.2002,397:305-311.
〔4〕 Liu N, Raja SM, Zazzeroni F ,et al.NF-kappa B protects from the lysosomal pathway of cell death\[J\].EMBO.2003,22:5313-5322.
〔5〕 贺茂林,陈安民.反义表达人组织蛋白酶L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响\[J\].中国矫形外科杂志2005,13:43-46.
〔6〕 吕浩然,刘尚礼.动物模型椎间盘退变全程基因变化的对比\[J\].中国矫形外科杂志2005,13:846-849.
作者单位：沈阳市骨科医院,沈阳 110044