Sox9基因治疗椎间盘退变的研究现状

【关键词】  椎间盘退变性疾病

    椎间盘退变性疾病(disc degeneration disease,DDD)是一种发病率及致残率极高的疾病，常引起以颈肩腰腿疼痛为主要表现的临床症候群，据资料表明，DDD患者占美国骨科住院人数的1/3以上，目前对DDD的常规治疗方法包括药物治疗、理疗、卧床休息、类固醇注射封闭以及手术治疗等。但是，这些措施仅能够改善疾病的临床症状，并不能从根本上减缓或终止退变的进程。因此，进一步研究椎间盘退变的发生机制，试图从分子水平上对椎间盘退变进行调控，从而对椎间盘退变进行治疗是非常有价值的。以往对DDD发生机制的研究主要集中在椎间盘的生物力学改变、椎间盘的自身免疫因素、炎症反应、细胞凋亡失衡及椎间盘的营养障碍等几方面。近期的研究显示，Sox家族的Sox9基因很可能与椎间盘退变有着密切的关系，现将其相关研究情况作一综述。

    1椎间盘退变与胶原改变

    椎间盘内含有大量的胶原，其中Ⅰ、Ⅱ型胶原是最主要的胶原，约占总量的80%，其次是Ⅵ型胶原，占10%~20%。在正常情况下，Ⅰ型胶原主要存在于外层纤维环，Ⅱ型胶原则主要分布在髓核和软骨终板。Ⅱ型胶原，在椎间盘中央含量最高，到边缘则逐渐减少，而Ⅰ型胶原则刚好相反。而且胶原在椎间盘内的分布情况并不随年龄的增长而改变。但是，随着椎间盘的退变，胶原的构成情况却发生了变化。在退变的早期，正常类型的胶原在它们的分布范围有增加的趋势，提示在退变早期椎间盘存在一过性修复反应，这一点已经在核中软骨细胞的Ⅱ型胶原mRNA增强表达得到证实［1］。髓核中，Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型胶原含量也有增加，Ⅰ型胶原在纤维环中也呈增加趋势。随退变程度的加重，胶原的性质发生了改变，Ⅰ型胶原开始出现在髓核中，软骨终板丧失了Ⅱ型胶原的表达。Ⅳ型和Ⅹ型胶原也在髓核中出现，胶原成分的改变说明髓核内软骨样细胞表型发生变化，可能失去了软骨特征而出现骨化现象。最后，胶原的翻译后修饰出现非酶糖化或脂质过氧化作用，交联增加。以上种种变化最终导致椎间盘细胞外环境的破坏，椎间盘的弹性和膨胀时的抵抗力减弱，这种改变极难自行修复。

    2Sox家族及Sox9基因

    1990年，Berta等［2］在人类和小鼠中克隆了睾丸决定因子SRY基因，人们发现SRY基因产物含有的一个保守区与一种染色体蛋白HMG-1和HMG-2中的DNA结合基序非常相似。HMG框是一个长约79个氨基酸的DNA结合基序，根据该HMG框的保守性，由此命名了编码一类新的转录因子的基因家族，称为Sox家族，该家族特点为其所编码的蛋白质与HMG框有60%同源性。2000年，Girard等［3］人利用已经克隆的Sox基因全长序列和大量的完整的HMG基序对Sox基因家族的分类进行了详细的研究，他们提出Sox基因家族可以分为A~J十个亚族。同一亚族内不同基因间在HMG基序内的相似性在80%以上；不同亚族间的相似性就低于这个数字。另外，同一亚族中同一Sox基因在脊椎动物中不仅在HMG基序区存在同源性而且在其他区也存在较大的相似民生。在哺乳动物发育过程中，Sox基因在广泛范围内表达。Sox1，Sox2，Sox3，Sox9和Sox11在神经组织中主同水平表达；Sox9在软骨组织中和性腺中表达；Sox2亦在鸡胚胎的晶状体和肠的表皮细胞中表达。

    Sox9基因是Sox基因家族成员之一，1994年，Zanaria等［4］克隆了Sox9基因，发现它与SRY的HMG框区域的同源性大于60%，基因定位于染色体17q24Ⅱ~25Ⅰ区段内，在男性睾丸的发育中与SRY基因相同，作为转录因子而调控其下游基因的表达。SRY基因并不是直接调节睾丸的发育而是通过Sox9共同作用才发生作用。Foster等［5］将从三个独立文库中分离得到的cDNA克隆序列组装出Sox9的复合转录单位，其长度为3934 bp，Sox9基因具有一个开放阅读框架（ORF），该框架能够编码509个氨基酸，其中104~182位的79个氨基酸残基编码HMG盒，与SRY基因的HMG盒编码序列同源性高达71%；除此之外，在其所编码的Sox9蛋白C端约1/3处有一富含脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸的区域，该区域类似于某些转达录因子的反式激活域（transactivation/transcription activation domain,TA域），这一非酸性区域在进化上相当保守，很可能Sox9蛋白因含有HMG盒样DNA结合基序及该TA域而具有转录因子活性。

    3Sox9基因与椎间盘退变

    椎间盘的退变与其内部的细胞外基质的改变有密切的联系。椎间盘的细胞外基质主要由抵抗张力的胶原和抵抗压力的蛋白多糖共同组成，而细胞外基质的稳定是椎间盘结构和功能的基础。因此椎间盘内胶原变化，包括胶原的成分和构象改变必将影响椎间盘的生物学性质，并且更易造成椎间盘退变［6、7］。Nerlich［8］和Ahsan等［9］的研究发现，随着年龄的增加，椎间盘髓核中胶原的类型发生变化，最初为Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型胶原的增加，随后为Ⅱ型胶原的丧失；椎间盘内蛋白聚糖含量逐渐下降，呈聚集状态的蛋白聚糖下降尤为明显，非聚集蛋白聚糖比例相对增加，这种变化在髓核更为显著。同时，伴随蛋白聚糖的下降，含水量明显降低。Oegema等［10］发现，间盘退变后，椎间盘细胞产生的基质金属蛋白酶（matrix metallporoteinases,MMPs）增多，抑制了基质合成。其它的研究结果还显示［11］，椎间盘的退变过程是由于细胞因子的减少和致炎因子的增多，导致MMPs活性增加，椎间盘软骨样细胞分泌蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原能力下降、降解加速。进而使椎间盘软骨样细胞赖以生存的细胞外环境被破坏，髓核内水分丧失，不能维持椎间盘内应有的张力，加剧细胞退变，并且这种改变很难自行修复。有资料显示Sox9、Ⅱ型胶原、aggrecan是最主要的三种软骨细胞因子［12~14］，并且Sox9被当作Ⅱ型胶原mRNA转录中的正向操纵了［15~17］；Sive等［18］用原位杂交方法分析了正常与退变椎间盘内Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白多糖三种软骨因子的表达状况，发现在退变的椎间盘的髓核与纤维环中Sox9与Ⅱ型胶原mRNA的表达明显降低。通过免疫定位分析方法发现椎间盘纤维环组织中Sox9的表达水平与年龄呈反比［19］。Paul等［20］在体外实验中发现Sox9腺病毒载体能够增加细胞内Sox9与Ⅱ型胶原的表达。同时在纤维环穿刺法制备的兔椎间盘退变的病理模型中注射重组腺病毒载体，发现注射Sox9腺病毒的椎间盘与注射病毒对照组相比仍能维持更好的软骨细胞表型。有学者更进一步的对不同时期椎间盘（包括新生儿椎间盘，正常椎间盘，退变各个时期椎间盘）应用RT-PCR、Westernblot和免疫组化方法检测髓核中Sox9、Ⅱ型胶原基因的表达，并分析两者的相关性，发现Sox9 mRNA在椎间盘髓核细胞中的表达从新生儿到严重的椎间盘退变的病人逐渐降低，且它在人的椎间盘退变过程中也有表达，从新生儿到严重退变的椎间盘细胞中，Ⅱ型胶原下降的幅度与Sox9降低的幅度基本一致，这表明椎间盘退变的发生一定与Sox9的表达降低有关系，Sox9在正向调控Ⅱ型胶原的合成方面发挥了重要的作用。另外，1993年，Tommerup等［21］通过对染色体易位断裂点定位作图，提出17号染色体短民Sox9如果发生突变，就可以导致躯干发育异常（campomelic dysplasia,CD）。CD是一种罕见的可致死先天性软骨骼发育异常综合征（国外报道发病率为05~1/10万），其典型病状是先天弓形和长骨扭曲，常合并四肢骨骼异常如先天性脊柱裂、多趾畸形和软骨形成障碍，患者常因呼吸衰竭而死于出生后的第一个月内，因为疾病的严重程度不一，极少数病人能活到成年。Lefebrve等［22］亦推测在CD患者中Sox9基因活性的降低将抑制Ⅱ型胶原的产生而导致严重的骨骼发育障碍。昆士兰大学的Wright等认为小鼠中的一种“短尾突变”实际上代表一种潜在的CD模式，Sox9是“短尾”鼠中有缺陷的基因，虽然不表现性反转，但这些小鼠应当也还有一系列其它骨骼发育上的异常。目前可引起椎间盘退变的各种因素恰恰也是可以诱发Sox9基因突变的因素，因此我们有理由怀疑，在椎间盘退变过程中，很可能也象“短尾突变”或“CD”一样，存在Sox9基因的突变。或者即使没有Sox9基因编码序列上的突变，也可能存在调控方面的缺陷。这些都十分值得我们进行更深入的研究探索。

    4Sox9对Ⅱ型胶原的调控机制

    虽然，当前已经确认Sox9是Ⅱ型胶原合成过程中的一个重要的转录因子，且其在软骨的发育、成熟过程中对Ⅱ型胶原的正向调控作用已十分明确，但其中确切的调控机制是什么呢？亦即Sox9是通过什么机制正向调控二型胶原蛋白表达呢？Lefebvre V等［22］在研究中发现，Ⅱ型胶原基因（Co12al）的内含子Ⅰ中一个最小的DNA元件引起了转基因小鼠中软骨特异性细胞的表达，并发现该元件在瞬时细胞转染实验中也是一个软骨细胞特异性的强增强子。Co12al的表达与软骨细胞中所表达的高水平Sox9 RNA和Sox9蛋白密切相关，实验证实这个最小的Co12al增强子是Sox9作用的靶序列，Sox9直接结合到这个最小的Co12al增强子的一段序列上并将该软骨细胞增强子激活，共转染实验中发现，在非软骨细胞中，Sox9也是作为一个有效地增强子激活剂而发挥作用。Lefebvre V设计出该增强子的突变体，使其不能与Sox9相结合，结果发现软骨细胞中增强子的活性消失，共转染的非软骨细胞中由Sox9引起的增强子的激活亦受到抑制。Lefebvre V将Sox9蛋白截短，去除其反式激活域（transactivation domain,TA域）部分但保留其与DNA结合能力，发现与全长的Sox9蛋白相比，增强子的活性受到了明显的抑制。以上试验结果强烈的表明Sox9参与了软骨细胞中Co12al的细胞特异性激活作用以及Ⅱ型胶原合成的调控，且其调控机制是通过Sox9蛋白的DNA结合域与Co12al增强子直接结合而发挥作用，而Sox家族的其他成员对该增强子并无激活作用。除了与DNA直接结合，Sox9是否还通过其他的方式（如信号通路等）调控Ⅱ型胶原的表达呢？目前并无相关报道。

    总之，椎间盘退变的基因治疗正处于早期的实验阶段，对Sox9基因在椎间盘退变中作用和机制的研究亦刚刚展开。随着分子生物学技术的发展和对椎间盘退变的生物学机理研究的不断深入，相信Sox9基因终将广泛应用到椎间盘退变的临床治疗中。

【参考文献】
  〔1〕Takaishi H,Nemoto O,Shiofta M,et al Type-Ⅱ collagen gene expression is transiently up-regulated in experimentally induced degeneration of rabbit intervertebral disc［J］Orthop Res,1997,15:528-538

〔2〕Berta P,Hawkins JR,Sinclair AH,et alGenetic evidence equating SRY and the testis-determining factor［J］Nature,1990,29;348(6300):448-450

〔3〕Girard F,Gremazy F,Berta P,et alExpression pattern of the Sox31 gene during zebrafish embryonic development［J］Mech Dev,2001,100:71-73

〔4〕Zanaria E,Muscatelli F,Bardoni B,et alA novel and unusual member of the nuclear hormone receptor superfamily is responsible for X-1inked adrenal bypoplasia congenita［J］Nature,1994,372:635-741

〔5〕Foster JW Dominguez-Steglich Ma Guioli S,et alCampomelic dysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY-related gene［J］Nature,1994,372:525-530

〔6〕Antoniou J,Goudsouzian T,Heathfield N,et alThe human lumbar endplate:evidence for changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth,maturation,ageing amd denaturation［J］Spine,1996,21:1153-1161

〔7〕Buckwalter,JA1995Spine update:aging and degeneration of the human intervertebral disc［J］Spine,20:1307-1314

〔8〕Nerlich AG,Schleicher ED,Boos NImmunohistologic markers for age-related changes of human lumbar intervertebral disc［J］Spine,1997,22:2781-2787

〔9〕Ahsan R,Tajima N,Chosa E,et alBiochemical and morphological changes in herniated human intervertebral disc［J］Orthop Sci,2001,6:510-518

〔10〕Oegema TR,Johnson SL,Aguiar DJ,et alFibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc［J］Spine,2000,25:2742-2747

〔11〕彭宝淦，贾连顺椎间盘退变机理的研究［J］中国矫形外科杂志，2000，7：390-392

〔12〕Zhao Q,Eberspaecher H,Lefebvre V,et alParallel expression of Sox9 and co12al in cells undergoing chondrogenesis［J］Dev Dyn,1997,209:377-386

〔13〕Lefebvre V,Crombrugghe BTowards understanding Sox9 function in chondrocyte differentiation［J］Matrix Biol,1998,16:529-540

〔14〕Hering TMRegulation of chondrocyte gene expression［J］Front Biosci,1999,4:743-761

作者单位：哈尔滨医科大学第一临床医学院骨二科，哈尔滨150001