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【摘要】 目的］通过体内实验的方法对新型β型钛合金（TiNbZr）骨折内固定材料的生物相容性进行评价。［方法］（1）改良的鼠气囊模型（the air pouch model）：健康成年SD大鼠24只，皮下充气造模后将钛铌铣β型钛合金（TiNbZr）颗粒混悬液注入气囊，收集囊内液体采用ELISA方法测定IL6和TNFα，用囊壁组织学切片进行炎症细胞反应分级和囊壁厚度测量，并与传统的钛铅钒合金（Ti6Al4V）进行比较。（2）接骨板植入模型：将TiNbZr做成接骨板固定在兔的胫骨上，于手术后4、8、12、24、36周分别观察接骨板周围的纤维膜形成情况和TiNbZr骨界面骨结合情况，并与不锈钢接骨板比较。［结果］（1）Ti6Al4V、TiNbZr两种颗粒注入气囊48 h后都能引起TNFα分泌量显著升高（P<005），两组比较，Ti6Al4V组明显高于TiNbZr组（P<005）。两种材料均不能引起IL6分泌的显著增加（P>005）。TiNbZr组气囊囊壁厚度明显小于Ti6Al4V组（P<0001）。（2）TiNbZr接骨板周围软组织反应与不锈钢相近。植入后4周，新生骨痂开始覆盖TiNbZr接骨板的两侧，8周时骨痂甚至部分覆盖接骨板和螺钉的表面形成“骨盖板”现象。12周时，骨与TiNbZr接骨板的界面为直接接触，中间无软组织间隔。螺钉与骨也能形成较为牢固的钉骨直接接触。［结论］低弹性模量TiNbZr β钛合金具有优良的体内组织相容性，是一种有前途的骨折内固定材料。
【关键词】 内固定 钛铌锆 生物相容性材料 体内研究
In vivo biocompatibility of beta titanium alloys for internal fixation instruments∥JIA Qingwei, NING Congqin, DING Dongyan, et al Department of Orthopedics, the 9th Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200011,China
Abstract［Objective］To develop new beta titanium alloys made of titanium, niobium and zirconium (TiNbZr) which have higher strength, lower moduli of elasticity Its biocompatibility in vivo is evaluated in this paper ［Method］(1) 24 SD rats were used in the modified air pouch model experiments Air was injected subcutaneously on the back of rats to form the pouches and the TiNbZr particles were introduced into them The liquid in the pouches was harvested 48 hours later for IL6 and TNFαELISA procedure and the capsules for histology examination All the results were compared with Ti6Al4V (2) TiNbZr bone plates were fixed onto tibias of rabbits The capsules around the plates and the bone under them were observed at 4, 8, 12, 24 and 36 weeks respectively TiNbZrbone interfaces were emphasized in this procedure This time the control material was stainless steel ［Result］(1)TiNbZr and Ti6Al4V particles made the air pouches secret more TNFα than that of the control (P<005) Ti6Al4V particles made the effect more prominent than TiNbZr particles did (P<005) This effect was not seen in IL6 menstruations experiments The thickness of the air pouches was different in two groups It was thinner in the TiNbZr group than that in Ti6Al4V group (P<0001)(2)After 4 weeks of TiNbZr bone plates' implantation the new callus formed beside the plates The “callus overlay the plate” phenomenon was seen after 8 weeks In 12 weeks a kind of direct integration had formed in the boneplates interfaces No soft tissue was seen in them The same direct integration was also seen in the bonescrew interfaces ［Conclusion］The TiNbZr beta titanium alloys developed in this study have lower modulus and high biocompatibility both Its perfect biocompatibility in vivo shows that it is a promising material for internal fixation instruments
Key words：internal fixaion;titaniumniobiumzirconium;biocompatible materials;in vivo
作者自行研制了低弹性模量钛铌锆β型（TiNbZr）合金〔1〕，在体外生物相容性实验取得良好结果的基础上，进一步对其体内生物相容性进行进一步的评价。考虑到TiNbZr作为骨折内固定材料的具体应用前景，实验将贾庆卫等 〔3〕的大鼠气囊模型（the air pouch model）应用于TiNbZr材料的生物相容性的评价，并将TiNbZr制成接骨板植入动物体内，观察骨和软组织对该材料的反应，为其临床应用提供更有价值的实验资料。
1材料与方法
11金属材料颗粒的制造与颗粒混悬液的制备
方法参见贾庆卫等〔2〕，人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究。
12大鼠气囊模型 (the air pouch model) 的建立
方法参见贾庆卫等〔3〕，改良大鼠气囊模型在人工关节假体松动研究中的应用。
13大鼠气囊模型对各种金属颗粒的生物学反应观察
健康成年SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只。分笼饲养2周无疾病表现者进入实验。氯胺酮腹腔麻醉，背部75%酒精消毒，皮下注入空气20 ml, 形成皮丘。48 h后气囊穿刺，再次注入空气10 ml。24 h后分别注入Ti6Al4V、TiNbZr颗粒混悬液5 ml（颗粒浓度25×107/ml），48 h后穿刺抽液，收集囊内液体，75 ℃冻存备用。
囊内液体采用ELISA方法测定IL6和TNFα。测定用ELISA试剂盒购自BioSource USA。操作方法同前。
14大鼠气囊模型对各种金属颗粒的组织学反应观察
48 h后大鼠颈椎脱臼法处死，背部正中切口，将气囊完整摘除，4%甲醛固定1周，脱水、透明、石蜡包埋，连续切片，厚度5 μm，常规HE染色，光镜观察。重点观察反应膜中的细胞构成，并按国家标准GB/T 161751996中植入实验炎症细胞反应分级标准进行分级（表1）。
表1GB/T161751996材料植入实验炎症细胞反应分级标准级别炎症细胞反应Ⅰ级试样周围未见或仅见极少量的淋巴细胞Ⅱ级试样周围可见少量淋巴细胞Ⅲ级试样周围有少量嗜中性粒细胞，淋巴细胞和巨细胞反应Ⅳ级试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎症反应，可见吞噬细胞
在放大100倍光镜下与显微标尺（10 μm）共同拍照，获得图像输入计算机，利用UTHSCSA ImageTool 300图像处理软件测量囊壁厚度。先利用标尺校准测量长度为10 μm，在囊壁处随机选取6个测量点，则可以读出每个测量点的厚度数值(图1)。
15TiNbZr接骨板的体内植入实验
采用317不锈钢和TiNbZr材料分别加工4孔接骨板（接骨板长40 mm，宽7 mm，厚2 mm，螺孔间距22 mm。螺丝钉外径2 mm，内径18 mm，长12 mm，螺帽直径4 mm）。选健康新西兰兔20只，体重25~30 kg。随机分为5组，每组4只。25%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉后，手术显露双侧胫骨中段，左侧以TiNbZr接骨板内固定（图2a），右侧以317不锈钢接骨板内固定作为对照（图2b）。术后动物分笼饲养，术后应用青霉素3 d，允许自由活动。
分别与手术后4、8、12、24、36周处死，切取接骨板表面软组织4%甲醛固定1周，脱水、透明、石蜡包埋，连续切片，厚度5 μm，常规HE染色，光镜观察。
重点观察反应膜中的细胞构成，并按国家标准GB/T 161751996中植入实验纤维囊腔形成分级标准进行分级。分级标准见表2。
表2GB/T161751996中材料植入实验纤维囊腔形成分级标准级别纤维囊形成Ⅰ级囊腔厚度稳定，无继续增生现象Ⅱ级纤维化囊腔致密，囊腔厚度较形成初期为薄Ⅲ级试样周围可以见到成纤维细胞、纤维细胞与胶原纤维并已形成囊腔结构Ⅳ级试样周围可见小血管、纤维细胞增生并开始形成疏松的囊壁
拆除接骨板后截取内侧钉孔之间的骨段，4%甲醛固定1周，75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水，透明MMA包埋，硬化后行50 μm切片，常规磨片、抛光、超声清洗。Van Gieson染色：01%甲酸2 min，流水洗涤2 min，20%甲醇2 h，流水洗涤2 min，60 ℃下Stevenol蓝染色15 min，60 ℃蒸馏水2 min，Van Gieson苦味酸品红染色8 min，100%乙醇脱水，中性树脂封片。
光学显微镜下观察，显微摄影数码相机摄取图像。
15统计学分析
实验测量结果经SAS 612软件处理。组内各参数之间的比较用方差分析，两组比较用q检验，以P<005表示差异有显著意义，P<001为差异有非常显著性意义。
2结果与分析
21大鼠气囊模型对金属磨损颗粒的生物学反应观察
Ti6Al4V、TiNbZr两种颗粒注入气囊48 h后都能引起TNFα分泌量显著升高（P<005），两组比较，Ti-6AI-4V组明显高于钴铬钼组和TiNbZr组（P<005）。
2种材料组的IL6分泌量对照组（钴铬钼）比较，但各组间无显著差异（P>005）(表3)。
表3钴铬钼、Ti-6AI-4V、TiNbZr气囊 TNFα
和IL6分泌量的比较（pg/ml）分组对照（钴铬钼）组Ti-6AI-4V组TiNbZr组TNFα1287±6642*16406±5623**8739±8236IL618898±3326△27297±461930035±4947*TNFα，对照组与每个实验组比较P<005;**TNFα，Ti6Al4V和TiNbZr组比较P<005;△IL6，对照组与每个实验组比较P>00522大鼠气囊模型对各种金属颗粒的组织学反应观察
Ti6Al4V组囊壁明显增厚，可见少量的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，炎症细胞反应为III级（图3）。
TiNbZr气囊较薄，炎症细胞反应为III级（图4）。
气囊囊壁厚度：Ti6Al4V组> TiNbZr组>空白对照组。两两比较，每两组间均有明显差异P<0001(表4)。
表4各种金属材料气囊囊壁厚度测量数值 （μm）组别分组N囊壁厚度（x±s）1空白对照361650750±1878582钛铝钒368308600±8374553TiNbZr364758420±785791
23TiNbZr接骨板的体内植入实验
一般情况：2只动物右侧切口（317不锈钢接骨板侧）发生术后切口感染，1只经切开引流愈合，另1例形成接骨板旁脓肿，至取材时才发现。感染动物实验数据未纳入统计。所有动物均无接骨板外露。图1光镜下囊壁厚度测量图片与10微米显微标尺（100×）
图2TiNbZr接骨板的体内植入实验图3Ti6Al4V囊壁组织光镜下形态，囊壁镜下为紧贴肌肉内层的纤维结缔组织膜，主要由纤维组织和成纤维细胞构成，囊壁内可见少量的淋巴细胞，炎症细胞反应为II级（HE染色，100×）图 4TiNbZr组囊壁光镜下形态，囊壁较薄，可见少量的中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，炎症细胞反应为III级（HE染色，100×） 图58周后骨痂开始覆盖TiNbZr接骨板的表面和螺钉，形成“骨盖板”的现象图6317不锈钢接骨板的两侧也可以见到骨痂的增生，但未覆盖接骨板的表面图7TiNbZr接骨板周围被新生的大量成熟的骨痂包绕，界面↑为骨与接骨板的直接致密结合，中间无纤维及胶原软组织间隔（Van Gieson染色，100×）图8317不锈钢骨板界面有纤维及胶原软组织间隔，可以见到软组织间隔剥脱。骨表面形成小的囊样变↑，内部被胶原组织填充（Van Gieson染色，100×）图9 317不锈钢和TiNbZr接骨板植入12周的螺钉钉道组织切片显示：317不锈钢和TiNbZr螺钉与骨都能形成较为牢固的钉骨直接结合，钉骨界面无软组织间隔（Van Gieson染色，40×）大体观察：从接骨板植入4周，新生骨痂开始覆盖TiNbZr接骨板的两侧，8周时骨痂甚至部分覆盖接骨板的表面和螺钉（图5）。12周后这种“骨盖板”的现象逐渐减少，至36周就极少见到。317不锈钢接骨板的两侧也可以见到骨痂的形成，但未见到覆盖接骨板的表面和螺钉的现象（图6）
接骨板骨界面观察： 接骨板植入12周，317不锈钢和TiNbZr接骨板与骨组织形成骨板界面。TiNbZr接骨板周围被新生的大量成熟的骨痂包绕，与大体观察中的“骨盖板”现象相吻合，界面为骨与接骨板的直接接触，中间无软组织间隔（图7）。
317不锈钢骨板界面可见部分致密结合，大部分骨的表面有纤维及胶原软组织间隔，由于取出接骨板时的破坏，形成可见的软组织间隔剥脱。骨表面形成小的囊样变，内部被胶原组织填充（图8）。
317不锈钢和TiNbZr接骨板植入12周的螺钉钉道组织切片显示：317不锈钢和TiNbZr螺钉与骨都能形成较为牢固的钉骨直接结合，钉骨界面无软组织间隔（图9）。
3讨论
生物相容性是任何新型生物材料进入临床应用以前必需认真考虑的问题。生物相容性评价是一个非常广义的概念。传统实验多采用皮内刺激实验、黏膜刺激实验、急性全身毒性实验、溶血实验、热源实验等方法。对于骨科内植物材料相容性的评价从开始就应该包括生物相容性和力学相容性两个方面。实验方法也应更加重视采用体内实验模型。
在前期的体外实验中作者得到结论：低弹性模量TiNbZr β钛合金具有优良的体外组织相容性，是一种有前途的人工关节假体材料。（1）工作中采用L929细胞（小鼠成纤维细胞）对合金进行细胞毒性试验，TiNbZr的细胞毒性为0级。（2）将1 μm左右的TiNbZr颗粒与J774A1巨噬细胞体外共同培养24~48 h后，吞噬了TiNbZr颗粒的J774A1巨噬细胞形态改变明显轻于钴铬钼颗粒组和钛铝钒颗粒组。巨噬细胞与钛铝钒合金颗粒、钴铬钼合金颗粒和TiNbZr颗粒共同培养48 h后都有IL6和TNFα mRNA表达的增加，钴铬钼颗粒和钛铝钒颗粒引起巨筮细胞增加更加明显。巨噬细胞吞噬TiNbZr颗粒48 h后分泌TNFα的量明显低于钛铝钒和钴铬钼（P<005）。
在金属磨损颗粒与巨噬细胞共同培养的实验中通常能发现钛合金的钒能刺激巨噬细胞产生更多的骨吸收因子，这些细胞因子在人工关节松动中起重要作用，所以β钛合金的发展趋势是选用生物相容性更好的元素。这是β钛合金生物相容性优良的物质基础。Seligson〔4〕采用经过表面硬化处理的Ti13Nb13Zr接骨板治疗羊胫骨骨折，固定16周后研究发现与Ti6Al4V相比β钛合金固定更加牢固，术后感染机会减少。
早期的β钛合金用钼取代了有细胞毒性的钒和铝。Khan证实Ti15Mo(TM)在模拟体液环境下有良好的耐腐蚀性能。在705例病人中作的金属敏感性实验说明含钼的β钛合金不会引发变态反应。现代的β钛合金则倾向于选取生物相容性更好的铌、锆、铊、钸等元素，如Long 〔5〕证实了Ti13Nb13Zr的生物相容性优良。Ti50Zr合金在Ringer’s和PBS液体中容易形成表面氧化膜，因而具有生物不敏感性〔5〕。日本学者研制的Ti29Nb13Ta46Zr在体外实验中表现出良好的生物相容性〔7、8〕。有研究表明，通过生物相容性元素Nb 、Ta、 Zr的严格组合可使潜在的组织反应达到最小。
骨科植入物材料力学相容性是必须考虑的生物相容性问题。目前临床常用的不锈钢、Co合金的弹性模量远远高于人体骨组织，这些材料与骨之间弹性模量的不匹配，使载荷不能由植入物很好地传递到相邻骨组织，出现“应力遮挡”现象，从而导致假体周围骨吸收和关节假体松动。我们在国内首次研制的TiNbZr合金的弹性模量为65 Gpa左右（最小52 GPa，最高仅为735 Gpa），已经达到某些碳纤维复合材料的水平〔10〕，与人体皮质骨的弹性模量更加接近。因此这些合金有望进一步减弱“应力遮挡” 效应。本研究中制备合金的强度大多在650~850 MPa之间；其延伸率也较高，最高可达23%。另外，所制备合金在铸造、热成型和机械加工方面已经显示出良好的性能。
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作者单位：上海交通大学附属第九人民医院骨科，上海200011