Literature
首页医源资料库在线期刊中国矫形外科杂志2008年第16卷第13期

细胞骨架蛋白destrin在创伤性动脉瘤血管壁组织中的表达及其临床相关性研究

来源:《中国矫形外科杂志》
摘要:【摘要】研究细胞骨架蛋白中destrin蛋白在创伤性动脉瘤血管壁组织中的表达情况及其与创伤性动脉瘤临床表现及病理特征等的关系,分析其在血管壁组织修复过程中的可能作用。[方法]采用Western-blot免疫印迹分析和实时荧光定量(RT-PCR)方法检测destrin蛋白在13例创伤性动脉瘤血管壁组织和8例正常人股动脉组织中的......

点击显示 收起

【摘要】  研究细胞骨架蛋白中destrin蛋白在创伤性动脉瘤血管壁组织中的表达情况及其与创伤性动脉瘤临床表现及病理特征等的关系,分析其在血管壁组织修复过程中的可能作用。[方法]采用Western-blot免疫印迹分析和实时荧光定量(RT-PCR)方法检测destrin蛋白在13例创伤性动脉瘤血管壁组织和8例正常人股动脉组织中的定量表达,比较其蛋白表达差异,并将结果与临床资料进行统计学分析,进行蛋白表达失衡与临床相关性研究。[结果]细胞骨架蛋白destrin在创伤性动脉瘤血管壁组织中的表达明显低于正常人胸主动脉组织,比较有统计学差异(P<0.05)。destrin的蛋白表达水平变化与吸烟显示相关,与年龄、受损动脉直径、高血压、术中发现血栓化程度等临床参数未见明显相关。[结论]细胞骨架蛋白destrin在创伤性动脉瘤血管壁组织中的表达相较正常人股动脉组织下调,该蛋白表达水平与创伤性动脉瘤临床相关参数(吸烟)有关。该研究为探讨TAA的潜在分子机理与防治措施奠定了初步依据。

【关键词】  动脉瘤 创伤 表达 基因 蛋白 destrin

   Expression of destrin in vessel wall tissue of traumatic arterial aneurysm and study of its clinical relativity∥TIAN Lei, ZHANG Lei, LU Qing-sheng,et al.Vascular Surgery of Changhai Hospital & Institute of Vascular Surgery of CPLA, Shanghai, 200433, China

    Abstract [Objective]To investigate the expression of protein destrin in cytoskeleton protein in traumatic arterial aneurysm (TAA) vessel wall tissue and its relationship with clinical representations and pathological characteristics.[Method]Western-blot analysis and RT-PCR were used to detect the quantitative expression of destrin protein in 13 patients with TAA and in the femoral arterial tissues of 8 normal subjects. The difference of protein expression was compared, and the results with clinical data were analyzed statistically. The correlation of unbalanced expression of destrin protein with the clinical presentations was studied. [Result] The expression of destrin in TAA tissue was lower than that in the femoral artery of normal subjects( P<0.05). The protein expression of destrin was correlated with smoking but not correlated with clinical parameters such as age, diameter of artery, hypertension, and intraoperative thrombus degree.[Conclusion]The expression of protein destrin in TAA tissue is lower than that in the femoral artery of normal subjects. The protein expression is correlated with smoking. The study may be helpful for the further investigation of the molecular mechanisms involved in TAA.

    Key words:traumatic arterial aneurysm;  trauma;  expression;  gene;  protein;  destrin

    创伤性动脉瘤(traumatic arterial aneurysm,TAA)是继发于各种局部创伤如骨折伤、穿刺伤、手术伤等引起的动脉管壁破裂、出血所诱发的假性动脉瘤,可发生于全身各处动脉,以四肢主干动脉居多,是外科常见疾病。目前认为,创伤性动脉瘤的发生与转归是动脉管壁损伤因素和动脉本身血流动力学因素共同作用的结果。因该病具有不稳定性,可引起各种严重并发症等临床特点,所以对这类损伤的早期正确诊断,手术及时修复损伤血管,促进管壁重建是减少并发症、保全肢体功能的关键[1]。虽然近年在TAA临床外科治疗中取得了一定经验,但是对损伤管壁组织重构的基础研究依然处于初步阶段,阻碍了对该病的进一步认识。因此,着眼于受损动脉管壁微环境重构的研究对该病的诊疗及预后均有重要意义。本研究所在前期研究中证实,动脉中膜平滑肌细胞骨架的肌动蛋白纤维重构是动脉为适应损伤后血流动力学及机械应力变化而发生的早期改变之一[2]。本研究在前期发现基础上,采用Western-blot免疫印迹分析和实时荧光定量PCR法,检测细胞骨架蛋白destrin在13例创伤性动脉瘤血管壁组织和8例正常人股动脉组织中的表达,比较其蛋白表达差异,并将该蛋白的表达水平与部分临床相关参数进行分析,初步分析其在创伤性动脉瘤发生发展中的可能作用,为TAA发生和进展机制的认识奠定了一定的实验基础。

    1  材料与方法

    1.1  标本采集:

    实验标本均选择发生于股动脉的创伤性动脉瘤损伤部位的血管壁组织和正常人股动脉组织。收集我院2005年2月~2007年12月间行自体或人工血管置换术切除的损伤性股动脉瘤新鲜标本13例,所选取的患者术前与术后诊断一致,病理证实均为急性创伤性动脉瘤,其中男性12例,女性1例,年龄28~57岁,平均年龄47.0岁,中位年龄51岁,其中既往高血压史5例(38.5%),吸烟史5例(平均460年支)(38.5%)。大体标本观察可见动脉环明显扩张,肉眼可见动脉中膜与外膜产生分离,壁间血肿者7例(53.9%)。正常股动脉新鲜标本8例均来自于尸检,其中男性7例,女性1例;年龄23~55岁,平均年龄44.1岁,中位年龄49岁,供者无血管疾病史,均死于非血管系统疾病。大体标本观察可见动脉环呈圆形,无扩张,动脉壁组织完整,弹性好。

    获取的所有标本均在动脉切除后30 min内采集,预冷生理盐水冲洗清除血管壁上的血液和附壁血栓后迅速冻存于-80℃冰箱中,以便下一步提取蛋白和mRNA。以上所有标本均经病理诊断证实,具备完整的病历资料。实验分组即分为TAA标本组(13例)和正常标本组(8例)。

    1.2  主要实验试剂与器材

    Trizol试剂(美国Invitrogen公司), MMLV逆转录酶、Taq酶等,荧光定量PCR仪及分析软件(BIO RAD公司),PCR引物与探针由上海生工生物技术有限公司合成,一步法试剂盒购自美国Invitrogen公司。一抗羊抗人多克隆抗体destrin、内参β-actin购自美国Santa Cruz公司,酶标二抗购自美国Sigma公司,内参二抗购自美国Santa Cruz公司,免疫印迹电化学发光试剂盒(美国Santa Cruz公司),DNA Analysis 2.0凝胶图像处理系统(美国Kodak公司),电泳系统及电转移装置(美国BIO-RAD公司)。

    1.3  实验方法

    1.3.1  实时荧光定量(RT-PCR)法检测mRNA表达:取组织样品100 mg应用Trizol法常规提取总RNA,微量核酸定量分析仪定量后取2μg总RNA,随机引物法逆转录合成cDNA。destrin引物与探针采用PRIMER 5.0引物设计软件设计,采用GAPDH作为内参照。destrin引物(扩增产物为164bp)上游5’-ATACAC

    AGGCACTACGAGAATGGAG -3’,下5’- CTTTTCTTGATTTCTTCTGGTGTGG -3’,探针5‘(FAM)-AAGGTCAGAGCCCTGGGCAGTGTTG -3’(TAMARA);GAPDH上游5‘- GACAACT

    TTGGTATCGTGGAAGG-3’,下游5‘- CCAGTAGAGGCAGGGATGATGT-3’,探针5‘(FAM)- CTCATGACCACAGTCCATGCCATCACT-3’(TAMARA)。采用一步法试剂盒进行RT-PCR实验,反应体系及反应条件严格按照说明书进行:反应总体积为30 μl,反应条件为95℃预变性4 min×60个循环。结果计算:CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所进行的有效循环数,重复扩增3次取平均CT值。TAA标本组与正常标本组的比较以目的蛋白(destrin)mRNA定量结果的平均CT值减去内标基因GAPDH的平均CT值得到△ C T值,以每组最小CT值作为矫正数,得到△△ C T值,计算2-△△ C T值,以2-△△ C T值为目的蛋白RNA表达量分析。

    1.3.2  Western-blot免疫印迹分析:参照Abcam公司说明书取组织样品100mg,加入1000 μl细胞总蛋白抽提液,冰浴匀浆使样品完全破碎后,转入1.5 ml的EP管中,高速离心机1 3000 r/min离心20 min。取其上清进行浓度测定。取40 μg蛋白样品加5倍电泳缓冲液,于100℃加热4 min变性后,经凝胶电泳、转膜、封闭和一抗、二抗孵育,增强发光,胶片曝光显影后,Kodak DNA Analysis 2.0凝胶图像处理系统测定目的显影条带和内参照β-actin的光吸收度A值,结果以比值(样本目的蛋白光吸收度A值/内参光吸收度A值)表示并分析。

    1.4统计学方法

    采用SPSS 10.0进行分析,定量资料采用均数±标准差形式记录,两组比较用t检验,多组比较用方差分析,临床因素相关性组间比较采用独立样本t检验,偏态分布用非参数检验。

    2  结果

    2.1  TAA受损动脉壁组织和正常动脉组织中destrin的表达水平差异

    RT-PCR与Western-blot检测destrin在两组动脉组织的表达发现: 21例标本mRNA水平与蛋白水平均有不同程度的表达,且destrin在TAA受损动脉壁组织中的表达明显低于正常人动脉组织,比较有统计学差异(P<0.05),mRNA结果为t=-2.595,P=0.03,蛋白结果为t=-6.908,P<0.001,两者结果一致,见表1和图1。

    表1  两组动脉组织中destrin的mRNA及蛋白表达组织类型例数Destrin mRNA表达Destrin蛋白表达TAA受损动脉138.88±2.101.09±0.05正常动脉组织826.34±6.402.15±0.17t值-2.595-6.908p值<0.05<0.001

    图1destrin的Western-blot检测电泳条带,可见destrin表达NA组条带明显强于TA组(P<0.01)

    2.2  destrin的表达与临床指标相关性分析  分别将TAA受损股动脉壁组织中的destrin的mRNA与蛋白表达量分别与患者年龄、受损动脉直径、高血压、吸烟、术中发现血栓化程度5项临床相关参数进行相关分析,结果显示destrin的蛋白表达量与吸烟有明显相关(t=-2.361,P=0.04),与其余临床参数均未见明显相关,见表2。

    表2  TAA受损动脉组织中destrin的表达与临床参数相关分析临床相关参数

   3讨论

    急性创伤性假性动脉瘤(TAA)实际上是骨折、外伤、医源性损伤等原因造成动脉管腔与外界形成异常交通,高压动脉血经异常通道反复冲击并形成以纤维假膜为被盖的搏动性血肿.严重者可侵犯静脉形成动静脉瘘,发生破裂和大出血,威胁肢体生存甚至生命,故必须尽早诊断和治疗[3]。血管创伤外科作为最年轻的外科领域之一,可以通过血管修补、吻合和血管、移植修复血管,恢复肢体循环和功能。组织病理学可见TAA动脉管壁在受损伤初期出现中膜平滑肌细胞弹力纤维紊乱、减少、断裂等变化,而手术修补破损后可出现平滑肌细胞、内皮细胞等的增殖、迁移等血管重塑过程[4]。细胞骨架是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构,对维持细胞的形态结构及内部结构的有序性,以及在细胞运动、物质运输、信息传递、细胞分化等方面起重要作用[5]。已有研究表明,动脉壁中有部分与微丝结合而产生作用的细胞骨架蛋白可能是动脉适应急性创伤的重要因子。因此,本研究聚焦于细胞骨架蛋白destrin在受损血管中的表达及与部分临床参数分析,探讨该蛋白在血管组织细胞骨架重构中的变化,从蛋白质水平揭示血管内皮及平滑肌细胞微环境的改变参与TAA发生和进展的机制。

    destrin又称消去蛋白,属于肌动蛋白纤维去聚合蛋白家族(ADF/cofilin家族)成员,该蛋白广泛分布于各种生命形式个体中。多方面研究认为[6]:真核细胞的胞浆、胞核与胞膜中均有该蛋白的存在,目前仅在红细胞系与部分生物的生殖细胞系中未见明确表达。本研究所应用免疫组织化学方法在血管壁全层的平滑肌细胞和内皮细胞中都发现了不同程度的destrin表达。研究发现[7]:destrin作为肌动蛋白结合蛋白中独一无二的解聚微丝的蛋白群,在结构上具有高度保守的肌动蛋白结合基团ADF-H。ADF-H与肌动蛋白结合,通过催化G-actin从F-actin突出端解离来加速肌动蛋白纤维动态变化,即通过切断肌动蛋白丝和增加解聚作用在肌动蛋白动力中发挥重要作用,而该解聚过程正是细胞发生迁移的分子机制。现有研究提示[4、8]:destrin等蛋白对肌动蛋白细胞骨架识别在许多细胞基础活动中扮演重要脚色,包括细胞增殖、黏附、形态发生和细胞动力学等方面。还有研究认为[9],该家族蛋白的表达控制着细胞的运动极性,这使得destrin在组织重构活动中不可或缺。本实验中,我们发现destrin在创伤性动脉瘤血管壁组织中的mRNA和蛋白表达均明显低于正常动脉组织,我们推测一方面这可能是在高压高速血流的冲击下,TAA血管管壁组织肌动细胞骨架遭到破坏后重组能力减弱、预后不佳的根本原因之一;另一面,destrin的表达下调对动脉破损后稳定残存血管管壁细胞骨架、维持残存血管管壁正常组织结构、有效抵抗血流冲击避免更大灾难有利。

    分别将TAA组中destrin表达量与患者年龄、受损动脉直径、高血压、吸烟、术中发现血栓化程度5项临床参数进行相关分析,显示destrin的蛋白表达量与吸烟有明显相关,与其余参数均未见明显相关。吸烟史的存在是动脉管壁硬化脆弱的重要危险因素,吸烟还可诱导体内儿茶酚胺水平的不稳定导致动脉内血流动力学改变,但其在疾病中作用的分子生物学机制并未完全清楚。我们的结果显示吸烟可能通过影响destrin的蛋白表达从而影响细胞骨架蛋白的稳定性,这可能是吸烟易致TAA等血管疾病发生的原因之一,值得深入研究。另外,虽然destrin的表达与动脉直径、高血压、瘤体血栓化程度等未见明显相关,但考虑到destrin的表达变化可能存在多种复杂的调节方式,还可能与本实验的标本总例数较少有关。目前尚不能排除其它结果,需进一步的大样本研究证实。

    综上所述,本实验通过研究细胞骨架蛋白destrin在创伤性动脉瘤血管壁组织中的表达情况,以及该蛋白与临床参数之间的关系,发现destrin在TAA血管管壁中表达下调,且在损伤血管中的表达水平与吸烟史的存在有关。其机制可能通过影响主动脉管壁的肌动蛋白细胞骨架的重组、参与细胞的增殖、迁移等的调控,从而在急性动脉损伤、TAA的发生、发展乃至预后中起着一定的作用,这种作用的确切机制及可能途径,还有待于进一步的研究证实。

 

【参考文献】
  [1] 李晓曦,王深明,黄灿之.创伤性周围动脉瘤的外科治疗[J].中国现代普通外科进展,1999,2:40-41.

[2] Erickson HP.Evolution of the cytoskeleton[J].Bioassays,2007,29:668-677.

[3] 王嘉桔.创伤性动脉瘤的早期诊断与治疗[J].中华外科杂志,1996,5:32.

[4] Sue SS,Takenawa T.Regulation of cortical actin networks in cell migration[J].Int Rev Cytol,2003,229:245-286.

[5] Pollard TD, Blanchoin L, Mullins RD. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,2000, 29:545-576.

[6] Galkin VE,Orlova A,Vanloock MS,et al.ADF/cofilin use an intrinsic mode of F-actin instability to disrupt actin filaments[J].J Cell Biol,2003,8,163:1057-1066.

[7] Andrey A,Bobkov, Andras M,et al. Cofilin (ADF) affects lateral contacts in F-actin [J].Journal of Molecular Biology,2004,337:93-104.

[8] Sarmiere PD, Bamburg JR. Regulation of the neuronal actin cytoskeleton by ADF/cofilin[J].J Neurobiol,2004, 58:103-117.

[9] Jpvceva E,Larsen MR, et al. Dynamic cofilin phosphorylation in the control of lamellipodial actin homeostasis[J].J Cell Science,2007,120:1888-1897.


作者单位:第二军医大学附属长海医院血管外科暨全军血管外科研究所,上海 200433

作者: 田磊
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具