体外镁合金与小鼠成骨细胞联合培养观察△

【摘要】  观察镁合金与小鼠成骨细胞体外联合培养后，小鼠成骨细胞的活力、组织形态变化及生长扩增情况。由此验证镁合金与成骨细胞的生物相容性和骨传导特性，探讨镁合金成为一种新型骨科内置物材料的可行性。［方法］将小鼠成骨细胞体外扩增培养，并应用钙钴法及Von Kossa法检测碱性磷酸酶加以验证。传代后将成骨细胞与镁合金金属片体外复合培养，细胞密度为3×104/ml。培养24、48、72 h后，分别进行扫描电镜（SEM）、共聚焦显微镜观察细胞形态学变化及生长情况。［结果］小鼠成骨细胞体外培养后大量扩增，细胞特性稳定。与镁合金复合培养后，细胞保持良好的活性和分裂增殖能力。SEM观察：细胞粘附明显，增殖分化良好；共聚焦显微镜观察：随时间段的延长，细胞形态完整，轮廓清晰，增殖明显。［结论］镁合金与小鼠成骨细胞具有良好的生物相容性，镁合金对成骨细胞具有良好的骨传导特性。因此，镁合金成为一种新型的骨科内置物材料具有较强的可行性。

【关键词】  镁合金 成骨细胞 生物相容性

    In vitro co-culcure of mouse osteoblasts combined with magnesium alloys∥YU Guo-ning, PAN Feng, WEN Jiu-quan, et al. Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,China

    Abstract：［Objective］To observe mouse osteoblasts vitality, histomorphology and growing development in vitro co-culture combined with magnesium alloys, confirm the biocompatibility of magnesium alloys and osteoblasts, and try to find out the possibility of magnesium alloys to be a new type of bone surgery implant material.［Method］Mouse osteoblasts were checked by Gomori and Von kossa stained, cultured and developed in vitro. Then the osteoblasts were mixed with magnesium alloys in a cell density of 3×104/ml. After 24、48、72 hours coculture, the surface of magnesium alloys were observed by scanning electron microscopy(SEM) and confocal microscopy to find the change of osteoblasts.［Result］After culture in vitro, the osteoblasts well developed, and expressed stable character. After coculture with magnesium alloys, the cells adhered and proliferated on the surface of alloys very well from SEM and confocal microscopy observation, which showed the osteoblasts had great activity and reproduce capability. ［Conclusion］Magnesium alloys showed good biocompatibility and bone conduction capability with mouse osteoblasts, so the magnesium alloy is very possible to be a new type of bone surgery implant material.

    Key words：magnesium alloy;  osteoblast;  biocompatibility

 镁合金作为一种可降解金属材料，近年来成为新型的骨科内置物领域的研究热点。本研究用小鼠成骨细胞与镁合金体外联合培养的方法，并与生物相容性好、可降解的多聚乳酸（PLA）作比较，初步评价其生物相容性及骨诱导性，从而为进一步动物体内实验做准备。

    1  材料与方法

    1.1  材料准备

    1.1.1  镁合金金属片  镁合金由镁（98%）、锰（1%）、锌（1%）组成，制成直径8 mm，厚度1mm的圆形薄片。中国科学院金属研究所提供。高温高压消毒后备用。

    PLA膜片

    PLA膜片：分子质量19 kd，孔径＜5 μm,制成直径8 mm,厚度200 μm的圆形薄片。武汉工业大学生物材料研究所提供。紫外消毒后备用。

    小鼠成骨细胞的制备

    1.2.1  细胞营养液配制  培养液使用DMEM低糖培养基（Gibco）加入20%灭活胎牛血清（杭州四季青），青霉素100 U/ml,链霉素100 U/ml；细胞消化液用胰蛋白酶（1∶250，Sigma）溶解于d-hank’s液，过滤灭菌。

    1.2.2  小鼠成骨细胞培养及检验  　　小鼠成骨细胞购自上海麦莎生物科技有限公司的MC3T3-E1小鼠成骨细胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态，应用钙钴法和Von Kossa法鉴定成骨细胞。取细胞生长融合成单层的盖玻片条，PBS冲洗3遍，2%硝酸钴浸泡5 min，双蒸水冲洗2遍，浸入2%硫化铵溶液1 min，双蒸水冲洗2遍，甘油明胶封固；另取一片细胞融合呈单层的盖玻片条，PBS清洗3遍，4%甲醛室温固定60 min, 再次PBS清洗2遍，加入新鲜配制的1%硝酸银，避光染色30 min，置于紫外灯下60 min,0.1%伊红复染。细胞培养扩增，当汇合到80～90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2传代，扩增至第5代。

    1.3  成骨细胞与镁合金的体外联合培养

    将消毒后的15枚金属片与9枚PLA膜片PBS冲洗2次，浸入培养液，入37℃、5%CO2培养箱中4 h后取出置于24孔板中。其中扫描电镜组9枚金属片（实验组）与9枚PLA膜片（对照组）分别分为3组，每组3枚；荧光组6枚金属片也分为3组，每组2枚。3组分别为培养24、48、72 h。将第5代小鼠成骨细胞以3×104/ml的密度接种于金属片和膜片上，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中，24 h换液1次。

    1.4  扫描电镜观察

    联合培养24、48、72 h后取出金属片和膜片，PBS冲洗，2%戊二醛固定，乙醇溶液梯度脱水置换，真空干燥6 h。喷金，日本岛津SSX-550型扫描电镜下观察。

    1.5  共聚焦显微镜观察

    联合培养24、48、72 h后取出金属片，PBS冲洗，2%戊二醛固定，0.3%Tritonx100透膜，应用一抗（rabbit antiactin alpha,北京博奥森）、二抗（FITC标记羊抗兔IgG,北京博奥森）免疫组化染色，避光，Leica SP2型共聚焦显微镜下观察。

    2  结  果

    2.1  成骨细胞鉴定

    相差显微镜下见细胞完全贴壁展开，形态不规则，多呈三角形和多角形，有较多突起。培养7 d后，钙钴法碱性磷酸酶（ALP）染色，显示成骨细胞胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒沉积（图1）；培养14 d后，Von Kossa法矿化结节染色，显示成骨细胞矿化结节呈黑色（图2）。

    2.2  扫描电镜观察

    联合培养24 h后，可见镁合金表面有的成骨细胞贴壁展开，形态不规则，有较多突起，有的细胞尚未贴壁，仍呈球形（图3a）；48h后，细胞数量有所增多，部分细胞间突起相互连接，局部可见细胞分裂相（图3b）；72 h后，镁合金表面细胞基本汇合成片，排列紧密，大多呈梭形(图3c)。而PLA膜片表面细胞形态及发展趋势与镁合金类似，但培养72 h后细胞数量较少（图4）。

    2.3  共聚焦显微镜观察

    应用FITC标记二抗显示细胞骨架，共聚焦显微镜下成骨细胞呈绿色荧光。联合培养24 h后，可见镁合金表面成骨细胞贴壁展开，形态不一，有突起，较杂乱（图5a）；48 h后，细胞数量有所增多，细胞表面较多突起，部分细胞间突起相互连接（图5b）；72 h后，镁合金表面细胞基本汇合成片，排列紧密，大多呈梭形，胞核清楚，轮廓清晰(图5c)。

    3  讨  论

    镁合金作为一种可降解的新型生物材料，既有高分子化合物的可降解性，又有金属材料的坚韧性，因此在骨科内置物领域具有良好的应用前景［1］。作为一种内置物材料，首要的一点就是要有良好的生物相容性，以减少和避免生物体的免疫排斥反应。本实验研究以早已被证实的具有优良的生物相容性，无毒性和可降解性的PLA膜片为对照，可以有效的说明这个问题。其中最直接的方法就是在相同条件下，观察成骨细胞在金属和膜片表面的生长和聚集情况，比较镁合金与PLA的骨传导生物活性［2］。

    　　从图3可以看出，随培养时间的延长，镁合金表面成骨细胞粘附、增殖、呈现出良好的生长趋势，并未出现细胞凋亡和中毒现象，这充分说明了镁合金良好的骨传导特性。而且与图4相比较，镁合金表面细胞的数量和形态都要明显优于PLA膜片表面，可以推测镁合金的生物相容性不低于PLA，而骨传导性要优于PLA。图5显示镁合金表面成骨细胞骨架清晰，细胞呈梭形排列整齐，再次证明了镁合金对成骨细胞的生长和增殖具有良好的促进作用。

    镁合金主要由镁离子组成，而镁离子是人体内第4大阳离子，其中一半的镁储存在骨组织中，是骨组织代谢的重要元素之一，对新骨的形成具有促进作用［3］。镁合金的骨传导性可以通过观察合金表面骨细胞沉积的密度和速度来判断。国内外有人对生物材料表面进行处理，如在金属表面镀有羟基磷灰石和镁离子，再观察成骨反应，以推测成骨反应中镁离子的生化作用，结果在有镁离子的金属表面成骨细胞粘附明显增多，金属界面强度明显增强，这说明镁离子在成骨细胞的粘附和增殖过程中发挥了很大的作用［4］。

    对于体外联合培养检测生物材料的组织相容性，接种细胞的选择有很多种，对于骨科内置物材料而言，骨髓基质干细胞（BMSCs）与成骨细胞都是较好的选择［5］。而BMSCs存在于骨髓中，且在一定条件下可向成骨细胞分化，因此在以后的实验研究中，可以利用BMSCs进一步研究镁合金的骨诱导性和植入体内后髓腔中的骨质反应。

    本实验研究所用镁合金材料，与目前的研究热点骨组织工程中的支架材料，具有良好的借鉴作用。理想的骨组织工程支架应具备：良好的生物相容性和可降解性，一定的机械强度能支持生理应力，合适的表面理化性质，易加工性及合适的三维微观结构［6］。在未来的实验研究中，可以在镁合金的表面理化性质与三维微观结构方面有所改进。图1  钙钴法染色  培养7 d后，可见成骨细胞胞质内灰黑色颗粒沉积（400×）  图2  Von Kossa染色  培养14 d后，可见成骨细胞形成矿化结节呈黑色（400×）  图3  SEM观察镁合金表面成骨细胞生长状况  3a  联合培养24 h   3b  联合培养48 h   3c  联合培养72 h（200×）

    4  结  论

    镁合金与成骨细胞体外联合培养，验证了镁合金具有良好的生物相容性和骨传导性，作为一种新型的骨科内置物材料具有巨大的潜力。但是同时应该看到，镁合金作为一种骨科内置物，虽然有乐观的前景，但同时也存在许多需要解决的问题。今后，应在镁合金的强度、降解速度的控制，以及可吸收材料的迟发性炎症反应等多方面做进一步实验研究。

【参考文献】
  ［1］ Saris NEL. Magnesium: an update on physiological, clinical and analytical aspects［J］. Clin Chim Acta，2000,294:1-26.

［2］ Witte F, Kaese V, Haferkamp H,et al.In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response［J］. Biomaterials，2005,26:3557-3563.

［3］ Revell PA, Damien E, Zhang XS, et al. The effect of magnesium ions on bone bonding to hydroxyapatite［J］. Key Eng Mater，2004：254-256.

［4］ Zreiqat H, Howlett CR, Zannettino A, et al. Mechanisms of magnesium-stimulated adhesion of osteoblastic cells to commonly used orthopaedic implants［J］. J Biomed Mater Res,2002,62:175-184.

［5］ 李文辉，侯莜魁，汤婷婷，等.藻酸钙凝珠复合骨髓基质细胞的体外培养［J］.中国矫形外科杂志，2003，6：409-411.

［6］ 王 林，王 臻，李 祥，等.大块组织工程骨支架结构设计制造及与人成骨细胞联合培养观察［J］.中国矫形外科杂志，2005，5：376-379.

作者单位：中国医科大学附属一院骨科 沈阳 110001