点击显示 收起
【摘要】 ［目的］探讨当归、阿魏酸钠关节腔注射对大鼠骨关节炎(OA)的疗效。［方法］40只大鼠木瓜蛋白酶法建立双膝OA模型，造模后分为模型对照组，25%及5%当归治疗组，0.5%及0.1%阿魏酸钠治疗组，另取8只大鼠作正常对照；各组关节腔注射相应浓度药物或生理盐水0.1 ml，3日一次；6周后检测血浆、关节液SOD、MDA，关节软骨取材光镜观察，检测软骨MMP-1、TIMP-1、Bcl-2、Bax的表达。［结果］25%当归和0.5%阿魏酸钠可增加血浆、关节液SOD活性(均P<0.05)并降低其MDA水平(均P<0.01)；降低关节软骨Mankin’s评分(均P<0.01），降低软骨细胞MMP-1、Bax的表达(P<0.05或P<0.01)，同时使TIMP-1、Bcl-2的表达增加(P<0.05或P<0.01)；5%当归无显著效果，0.1%阿魏酸钠对部分检测指标有统计意义。［结论］当归、阿魏酸钠关节腔注射治疗大鼠OA均有疗效，其作用具有剂量依赖性，阿魏酸是当归注射液治疗OA的有效单体成分。
【关键词】 骨性关节炎； 当归； 阿魏酸钠； 金属蛋白酶类； 细胞凋亡
Therapeutic effects of angelica and sodium ferulate on experimental osteoarthritis in rats∥LIU Bao-xin, CHEN Liao-bin, WANG Hui, et al.Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
Abstract: ［Objective］To explore the therapeutic effects of angelica and sodium ferulate (SF) on experimental osteoarthritis and the related mechanisms in rats. ［Method］Animal models of osteoarthritis were established in 40 rats by intra-articular injection of 4% papain. The rats were divided into five groups - model control group,25% and 5% angelica treatment groups, 0.5% and 0.1% SF treatment groups.Another additional 8 rats were used as normal control. Bilateral knees of the animalsin the treatment groups began receiving intra-articular injection of 0.1ml angelica injection or SF of corresponding concentration respectively every 3 days while those of the animals in the control groups received saline. All the animals were sacrificed 6 weeks later and samples of the cartilage, plasma and synovial fluid were taken. The contents of MDA and the activities of SOD in the plasma and synovial fluid were detected.Histological examinations of the cartilage were performed and immunohistochemical analyses for MMP-1, TIMP-1, Bcl-2 and Bax in the cartilage were done.［Result］25% Angelica and 0.5% SF significantly decreased the levels of MDA in both plasma and synovial fluid (P<0.01, P<0.01) while they increased their SOD activities (P<0.05, P<0.05). In the meantime, Mankin's scores of cartilage were reduced (P<0.01, P<0.01), and the gray scores of MMP-1 and Bax in the cartilage were reduced too(P<0.05, P<0.01) while those of TMP-1 and Bcl-2 were increased (P<0.05, P<0.01). 5% angelica had no significant effect on all the parameters while 0.1% SF took significant effects on most of the parameters.［Conclusion］Injected intra-articularly, both angelica and sodium ferulate have beneficial effects on osteoarthritis in rats. Ferulate is one of effective components of angelica in treating osteoarthritis.
Key words：osteoarthritis; angelica; sodium ferulate; metalloproteinases; apoptosis
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病。因其病程较长，病情反复发作，严重影响了中老年人的生活质量， 目前尚缺乏对疾病本身有特效的治疗药物。当归(angelica，AG)是明清以来治疗OA的中医方药中应用频率最多的中药［1］。当归注射液是当归的水溶液，阿魏酸是当归注射液的单体成分，药理作用与当归注射液相近。本实验将不同浓度的当归、阿魏酸钠(sodium femlate，SF)关节腔注射治疗大鼠实验性OA，以观察其疗效并研究相关机制，同时探讨阿魏酸是否为当归注射液治疗OA有效的单体成分。
1 材料与方法
1.1 药物、试剂与仪器：25%当归注射液(武汉大学中南医院制药厂)，阿魏酸钠粉针(重庆药厂)；木瓜蛋白酶(Merck公司)；基质金属蛋白酶1(matrix metallo proteinase-1，MMP-1）及金属蛋白酶组织抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)抗体，Bcl-2蛋白、Bax蛋白抗体，SABC、DBA试剂盒(武汉博士德)。765紫外分光光度计(shimadzu UV120-02)，HPIAS-1 000高清晰度彩色病理图像分析系统(同济千屏)。
1.2 动物与造模：健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，体重200～220 g。正常饲养1周后，随机抽取40只，参照文献方法［2］，双膝关节分别注射4%木瓜蛋白酶0.1 ml，1次/3 d，共注射3次。剩余8只同法注射等量生理盐水。
1.3 分组：造模末次注射1周后分组，未造模的8只作为正常对照组。造模的40只随机分为5组：模型对照组、25%AG治疗组、5%AG治疗组、0.5%SF治疗组、0.1%SF治疗组，每组8只，雌雄各半。各治疗组双膝关节分别注射25%、5%AG，0.5%、0.1%SF各0.1 ml，3 d一次，正常组和模型对照组按同法注射生理盐水0.1 ml作对照，6周后取材。
1.4 取材与检测：①采用心脏取血3 ml，肝素抗凝3 000 r/min离心取血浆。取血后气栓法处死，双膝关节分别用0.15 ml双蒸水反复抽吸冲洗，30 s后双膝共抽取关节洗液0.16 ml左右。邻苯三酚法测定血浆、关节液超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)活性，TBA分光光度法测定血浆、关节液丙二醛(maldialdehyde，MDA)含量。②切开双膝关节，肉眼及手术显微镜观察软骨表面。切下右侧胫骨上端，常规固定、脱水、包埋、切片(免疫组化切片行多聚赖安酸处理)，HE及甲苯胺蓝染色，光镜观察软骨的改变。③MMP-1、TIMP-1、Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表达采用免疫组化方法进行检测，方法步骤按照各试剂盒说明进行。图像分析处理：在40倍显微镜下随机选取8个不重叠的视野，测定阳性细胞的灰度值，取每张切片均值作为其测量值。
1.5 统计学处理：所有数据以(x-±s)表示，采用SPSS 13.0统计包进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肉眼及手术显微镜下观察
各组关节软骨按Mankin’s关节软骨大体评分标准［3］评分无显著差别。关节软骨表面光滑，模型及5%AG治疗组关节软骨表面呈淡黄色，其他各组呈淡蓝色。
2.2 HE、甲苯胺兰染色光镜观察及评分
模型与5%AG组切片光镜观察：软骨表面有小裂纹与溃疡，细胞明显增生，大小不一，四层结构紊乱，潮线不清晰或多重，甲苯胺兰染色重度降低；25%AG、0.5%SF、0.1%SF组软骨表面光滑、完整，细胞排列稍有紊乱，四层结构清晰，潮线清晰完整，甲苯胺兰染色前两组着色正常或轻度降低，0.1%SF组中度降低。按Mankin’s标准评分并进行统计(表1)，结果显示：与模型组比较，除5%AG组外，其余各治疗组均降低了Mankin’s评分(均P<0.01)，且25%AG与0.5%SF治疗组间无明显差别(P>0.05)。 表1 各组软骨组织Mankin’s评分 注：与模型组比较，##P<0.012.3 当归、阿魏酸钠对血浆、关节液SOD、MDA的影响
模型对照组血浆、关节液SOD有明显的降低(均P<0.01)，MDA明显升高(均P<0.01)，符合OA的生化改变。25%AG与0.5%SF能显著提高血浆与关节液中的SOD活性(均P<0.05)，降低MDA的水平(均P<0.01)；5%AG与0.I%SF对血浆与关节液SOD无明显作用，但5%AG可显著降低关节液MDA的水平(P<0.05)，0.1%SF可显著降低血浆与关节液的MDA水平(P<0.01或P<0.05)。具体结果见表2。表2 各组动物血浆、关节液SOD(KU/L，x-±s)及MDA(umol／g.pro，x-±s)组别n血 浆关节液SODMDASODMDA正常组882.73±12.07##0.73±0.08##904.42±126.76##0.71±0.14## 模型组852.51±16.571.19±0.15589.52±144.971.09±0.8825%AG组870.99±12.81#0.92±0.13##795.96±207.71#0.88±0.19#5%AG组863.09±22.351.11±0.10655.34±136.021.00±0.08#0.5%SF组880.89±28.53#0.77±0.10##805.13±153.93#0.85±0.09##0.1%SF组867.96±11.880.99±0.08##685.55±99.240.96±0.08# 注：与模型组比较，#P<0.05，##P<0.012.4 免疫组化及图像分析
切片用DBA染色的阳性结果为软骨细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒，阴性胞浆不着色或仅有背景着色，各组切片图像分析结果见表3。相对于模型组，25%AG和0.5%SF治疗组软骨细胞MMP-1、Bax蛋白表达的灰度值显著降低(P<0.05或P<0.01)，TIMP-1、Bcl-2蛋白表达的灰度值显著增加(P<0.05或P<0.01)；5%AG、0.1%SF治疗组软骨细胞MMP-1、TIMP-1的灰度值无明显影响，但0.1%SF治疗组软骨细胞Bax蛋白表达的灰度值显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白的灰度值显著增加(P<0.05)。表3 MMP-1、TIMP-1、Bcl-2、Bax在各组软骨表达的灰度值x-±s)组别nHMP-lTIMP-1Bax蛋白Bcl-2蛋白正常组8217.45±21.04##213.49±20.97##215.14±15.43##210.64±17.73##模型组8152.56±22.64180.47±32.60149.31±12.77189.21±34.2125%AG组8172.46±19.72#159.46±24.76#170.69±14.14##158.21±22.61##5%AG组8157.74±19.72175.96±31.94158.04±26.70177.21±18.950.5%SF组8186.04±31.18#157.11±23.54#186.06±31.16##148.36±16.21##0.1%SF组8170.31±27.12168.44±26.77165.68±22.98#166.31±23.86 注：与模型组比较，#P<0.05，##P<0.013 讨论
中药是中国医药学的瑰宝，在当今世界“回归自然”理念的影响下，中药正以其丰富的自然资源、独特的疗效、毒副作用少等特点，越来越引起世人的关注。WTO的加入为中药带来了前所未有的发展机遇，而知识产权的保护又为我国新药研制带来了前所未有的挑战。针对某种疾病筛选出理想的中药，分析其活性成分并进行结构改造可成为创新药物的途径之一。本实验针对OA，参照传统治疗，筛选出中药当归，观察了不同浓度的AG及其单体成分(SF)关节腔注射治疗OA的疗效。结果，除5%AG外，25%AG与0.5%SF、0.1%SF均有明显的效果，促进了退变软骨的修复。这说明，一定浓度的AG与SF关节腔注射治疗OA均具有明显的效果，阿魏酸是AG治疗OA有效的单体成分。
对于OA的发病机制，目前尚未完全研究清楚。但从病理角度看，软骨细胞赖以生存的细胞外基质异常降解是导致软骨退变的重要原因之一，许多体内外的研究已证明，自由基、细胞凋亡、基质金属蛋白酶类等因素在这一降解过程中起重要作用。本实验主要观察两种药物对这三种因素的影响以探讨药物作用的相关机制。OA的发病机制中研究较早的是关节局部的脂质过氧化反应，脂质过氧化反应可导致软骨基质降解，引起软骨的退变，表现为SOD的活性消耗性下降，MDA含量增高。反之，氧自由基代谢紊乱的恢复也可促进关节软骨退变的恢复［4、5］。随着对OA的研究深入，发现OA的发生与软骨细胞过度凋亡密切相关，并受相关基因调控。Bax蛋白为促凋亡基因蛋白，Bcl-2蛋白家族为目前发现的最重要的抗凋亡基因蛋白。Bcl-2蛋白抗凋亡作用与其跨膜蛋白抑制Ca++超载，阻止凋亡基因信号传递或基因产物的诱导及抑制自由基的产生有关。同时，研究也表明Bcl-2蛋白对细胞凋亡的影响与Bcl-2蛋白及Bax蛋白之间的比率大小有关，当Bcl-2蛋白高表达时，可形成Bcl-2-Bax异源二聚体，抑制细胞凋亡［6］。近年来，金属蛋白酶类(MMPs)逐渐成为OA发病的研究热点，MMPs是一组能降解细胞外基质的蛋白酶家族，可造成关节软骨肿胀，抗外力作用下降，最终导致对关节软骨造成进行性破坏。目前的研究发现，OA的发病主要与MMP-1、3、7、9、13相关，而破坏II型胶原最主要的蛋白酶是MMP-1。金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能与相应的MMPs特异性结合，抑制其生物活性的发挥，抑制MMPs的破坏作用，从而促进退变软骨的修复［7］。
本实验中，一定浓度的AG与SF均能较好地升高血浆与关节液的SOD活性，降低MDA的水平；抑制MMP-1与Bax的表达而增强TIMP-1与Bcl-2蛋白的表达，促进了Bcl-2／Bax比率失调的恢复，从而对OA起到了较好的治疗效果。同时，实验也观察到，当两种药物浓度较低时，对自由基、基质金属蛋白酶类、细胞凋亡的多数指标影响较小。这说明，这两种药物对3种因素的影响具有一定的剂量依赖性。
当归注射液是一种含多种成分的醇提取水溶液，阿魏酸是当归注射液中重要的单体成分之一。据文献［8］报道，25%当归注射液0.1 ml含阿魏酸5.14×10-7 g，而本实验所用0.5%阿魏酸钠注射液0.1 ml含阿魏酸5×10-4 g，两者在阿魏酸含量上相差3个数量级，而疗效无明显差别，可见当归注射液中还含有其它的有效治疗成分。但阿魏酸作为一个有效的单体药物，普遍存在于多种中草药中，又能通过简单原料经化学工艺进行合成，便于规模生产，在临床应用中应该会有较好的前景。
【参考文献】
［1］ 郑红.明清医家论治骨痹(骨关节炎)用药规律研究［J］.山东中医药大学学报，2003，27：95-97.
［2］ Lin YS, Huang MH, Chai CY. Effects of heliumneon laser on the mucopolysaccharide induction in experimental osteoarthritic cartilage［J］.Osteoarthritis Cartilage，2006,14:377-383.
［3］ Hayami T, Pickarski M, Zhuo Y, et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis［J］. Bone, 2006,38:234-243.
［4］ Regan E, Flannelly J, Bowler R, et al. Extracellular superoxide dismutase and oxidant damage in osteoarthritis［J］. Arthritis Rheum, 2005,52:3479-3491.
［5］ Ostalowska A, Birkner E, Wiecha M, et al. Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in synovial fluid of patients with primary and secondary osteoarthritis of the knee joint［J］. Osteoarthritis Cartilage, 2006, 14: 139-145.
［6］ 赵庆华，亓建洪，魏然.BaxmRNA在骨关节炎软骨组织中的表达及意义［J］.中国矫形外科杂志，2003，11：1364-1366.
［7］ Davidson RK, Waters JG, Kevorkian L, et al.Expression profiling of metalloproteinases and their inhibitors in synovium and cartilage［J］.Arthritis Res Ther，2006，8：124.
［8］ 朱蕙，查仲玲，杨瑜，等.当归注射液中阿魏酸的含量测定［J］.医药导报，2003，22：886-887.
作者单位：（1.武汉大学中南医院骨科，武汉 430071；2.武汉大学医学部药理系，武汉 430071）