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【摘要】 ［目的］探求发育性髋脱位(developmental dislocation of the hip,DDH)患儿与正常儿圆韧带中Ⅰ、Ⅲ型胶原在mRNA及蛋白水平的表达差异。［方法］选取性别相同年龄相近的6对发育性髋脱位患者及正常儿配对比较。采用半定量RT-PCR及Western-Blot法检测COL1a1、COL3a1在mRNA及蛋白水平的表达。图像分析软件进行量化分析，并经统计学处理。［结果］COL1a1在DDH组mRNA及蛋白水平表达均较正常对照组降低(P<0.01)；COL3a1在DDH组mRNA及蛋白水平表达与正常对照组无显著差异(P>0.05)。［结论］DDH患儿圆韧带中I型胶原在mRNA及蛋白水平表达较正常同性同龄儿降低，可能是导致DDH患儿髋关节松弛的原因。DDH患儿髋关节松弛可能与Ⅲ型胶原含量无关。
【关键词】 发育性髋脱位； 圆韧带； 关节松弛； 胶原
Expression of COLlal and COL3al in the ligamentum teres of developmental dislocation of the hip∥WANG En-bo, ZHAO Qun, LI Lian-yong, et al. Department of Pediatric Surgery, the Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China
Abstract: ［Objective］To investigate the expression of collagen type I and III at mRNA and protein level in the ligamentum teres of developmental dislocation of the hip(DDH) and the normal hip. ［Method］There were 6 pairs joint laxity of patients of DDH group and normal control group with paired control of same sex and age.Semiquantity RT-PCR method was used to detect the COLlal and COL3al in the ligamentum teres at mRNA level. Western-Blot method was used to detect the COLlal and COL3al in the ligamentum teres at protein level. The quantitative analysis of the COLlal and COL3al were performed by professional image software and the results were analyzed with standard statistical methods.［Result］At both mRNA and protein level COLlal expression were decreased in the DDH group compared to the control group(P<0.01). There was no significant difference for COL3al between DDH and control group at either mRNA or protein level (P>0.05).［Conclusion］The decreased collagen I expression at mRNA and protein level in the ligamentum teres of the children with DDH may lead to hip joint laxity.Hip joint laxity in DDH may be independent to the content of collagen III.
Key words：developmental dislocation of the hip; joint laxity; ligamentum teres; collagen
关节囊与韧带松弛是导致发育性髋脱位(developmental dislocation of the hip,DDH)的主要因素之一。胶原纤维是构成圆韧带中细胞外基质的主要成分，并使其保持一定的强度和韧性。各型胶原结构和(或)含量的变化可能会导致其拉伸增强作用下降，发生关节松弛。目前关于DDH圆韧带内胶原蛋白的研究国内外报道较少。本研究应用分子生物学检测技术比较Ⅰ、Ⅲ型胶原在转录水平和蛋白水平的表达差异。试图从分子水平揭示DDH患儿髋关节松弛的机理。
1 材料和方法
1.1 标本来源及制备
DDH组髋圆韧带标本6例，均无家族史，不合并其他畸形。来源方式：手术复位中切除的患髋圆韧带。与DDH组性别相同年龄相近(<6个月)正常儿童髋关节圆韧带6例。来源方式：4例来源于股骨颈肿瘤手术切除之圆韧带，2例来源于意外死亡后尸检。取材部位及方法同DDH组。
以上标本获取均获得监护人书面授权，并获得医院伦理委员会书面认可。
剪取原韧带中间1／3部分深低温保存。
1.2 半定量RT-PCR
1.2.1 组织总RNA提取
圆韧带组织总RNA提取按照Invitrogen公司(美国)提取试剂盒说明书进行。紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度，纯度为1.69～1.94。
1.2.2 逆转录合成cDNA
参照TAKARA公司逆转录试剂盒(大连TAKARA公司)说明书进行。在20 μl反应体系中另加入样本RNA模板2 μl,2×Buffer 10 μl； 25 mmol/L MgSO4 4 μl；10 mmol/L dNTPs 1 μl；22 u／μl AMV 1 μl；50 μmol/L ligo-dT 1 μl；40 u／μI RNase inhibitor 0.5 μl； ddH20 0.5 μl。混匀后置于下列温度反应：65℃1 min，30℃ 5 min，于30 min匀速升温至65℃，65℃30 min，98℃5min，5℃5min。
1.2.3 聚合酶链反应
在25 μl反应体系中，分别加入：DNA；ddH20；PCR buffer(10×)；dNTPs(各2.5 mmol/L)；TaqDNA聚合酶(5 u／μl)；待测指标的上游引物和下游引物(上海英俊生物公司)；引物终浓度为5～20 pmol/L。各指标及内参GAPDH引物的序列、扩增条件见表1。表1 PCR引物序列及产物长度引物名称核苷酸序列产物长度
(bp)Genebank循环条件COLlal
上游5’-AACATAATCCGCAGTGGCCT-3’
下游5’-CTCCTGTTGCGTTGCTCCTT-3’509BC03653194℃ 3 min， 94℃ 30 s
65℃ 40 s，72℃ 1 min
35个循环后，72℃ 7 minCOL3al
上游5’-CCCAGAACATCACATATCAC-3’
下游5’-CAAGAGGAACACATATGGAG-3’366NM00009094℃ 3 min， 90℃ 30s
58℃ 40 s， 72℃ 1 min
35个循环后，72℃ 7 minGAPDH
上游5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’
下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’307XR01831795℃ 3 min， 95℃ 30 s
60℃30 s，72℃1 min
40个循环后，72℃ 7 min1.2.4 PCR产物电泳及检测
取反应产物10 μl在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下检查特异条带，1Dkodar成像系统成像，应用Scion image软件对条带灰度进行半定量分析。
1.3 Western-blot
1.3.1 胶原标本制备
标本称重，在酸性条件下(0.5 mol/L乙酸,pH2.5)以10%胃蛋白酶消化22 h。-4℃19 000 r/min离心1 h，2 mol/L NaCl加入上清，-4℃19 000 r/min离心1 h，上清即为可溶胶原。
1.3.2 蛋白定量
按酚试剂法测定并调平蛋白质浓度。
1.3.3 变性
加入2%β-巯基乙醇100℃变性1 min。
1.3.4 电泳
取20 μl蛋白上样，经7.5%聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)电泳2 h，电压130 v。
1.3.5 转膜
将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转移至硝酸纤维素膜上，2 h，电压40 v。
1.3.6 封闭
TBS洗膜1次，加入含8%BSA的TTBS 4℃过夜。
1.3.7 一抗孵育
TBS洗膜3次，每次5 min，分别加入山羊抗人、兔抗人多克隆抗体(1∶1 000)(Santa公司，美国)，室温下2 h。
1.3.8 二抗孵育
加入碱性磷酸酶标记的二抗(1∶200)(北京中山生物公司)，室温4 h。
1.3.9 显色
以碱性磷酸酶染色液染色。
1.3.10 结果分析
用自动电泳凝胶成像系统采集图像，应用Scion Image软件对免疫印迹条带进行半定量分析。
1.4 统计学处理
采用SPSS软件(10.0版本，美国)进行统计学分析，P<0.05视为统计学上显著差异。配对比较采用配对t检验。
2 结果
2.1 RT-PCR
DDH组小儿圆韧带COL1a1 mRNA的表达较对照组降低(P<0.01)；COL3a1 mRNA表达与对照组无显著差异(P>0.05)。见图1及表2。
2.2 Western-blot
DDH组小儿圆韧带COL1a1的蛋白表达较对照组降低(P<0.01)，COL3a1的蛋白表达与对照组无显著差异(P>0.05)，见图2及表3。表2 6对DDH组与对照组小儿圆韧带COL1a1、COL3a1 mRNA的表达编号性别DDH组对照组年龄（岁）COL1a1/GAPDH*COL3a1/GAPDH**年龄（岁）COL1a1/GAPDH*COL3a1/GAPDH**1男3.10.410.592.61.070.822女3.30.440.662.80.720.633女4.90.580.665.00.890.684男5.00.290.865.00.770.825女6.70.430.757.11.040.716女9.20.410.738.80.980.75 配对T检验：*P=0.001；**P=0.556表3 6对DDH组与对照组小儿圆韧带COL1a1和COL3a1的蛋白表达差异编号性别DDH组对照组年龄
3 讨论
以往的研究发现髋脱位患儿多伴有关节松弛，这与髋脱位术中所见松弛薄弱的关节囊与圆韧带相符。因此髋关节松弛是导致髋脱位主要因素之一也得到了普便认同［1］。但作为杵臼关节的髋关节要保持稳定，主要依靠骨的形态，而关节囊及圆韧带则能保持它们固定于正常的位置。人类出生时髋臼较浅，股骨头表面为平滑弧线，出生后髋臼不断加深，股骨头弧度加大，髋关节逐渐稳定，而这需要头臼同心的相互作用才能达到。而关节囊和圆韧带则具有保持这种头臼同心位置的重要作用。
构成圆韧带并发挥抗生物张力生理功能的主要成分是胶原纤维。胶原是人体中最为丰富，分布最为广泛的一组糖蛋白分子，约占人体蛋白总量的30%。胶原分子是由三条多肽链形成的一种特殊的右手三螺旋结构，并根据其结构特点分为两大类［2］：即经典的纤维形成胶原和非纤维形成胶原。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型是最为经典纤维形成胶原。这三种胶原约占体内总胶原的80%～90%，因此也成为研究的重点。胶原分子主要由成纤维细胞、成骨细胞等合成、分泌。具有三螺旋结构的胶原分子被转运至细胞外通过共价键相互交联形成胶原纤维［3］。圆韧带主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原参与构建，Ⅰ型胶原分子式为［α1(Ⅰ)］3或［α1(Ⅰ)］2［α2(Ⅰ)］，Ⅲ型胶原分子式为［α1(Ⅲ)］3，因此α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)可以分别代表I、Ⅲ型胶原的含量［4］。
Bland于2001年发表了关于家兔髋关节发育过程中胶原变化的研究［5］。该研究主要应用免疫组化及原位杂交的方法，观察了从17 d胎兔至2岁成年兔圆韧带中胶原的分布及演变规律：17 d胎兔可分辨圆韧带，在发育的初始阶段为I、V型胶原遍布圆韧带，Ⅲ型胶原仅局限于韧带表面及止点处，韧带内细胞表达I型胶原mRNA，出生后这种分布仍然保持，但Ⅲ型胶原也开始遍布圆韧带。成年后家兔圆韧带已被含有Ⅲ、V型胶原的鞘所包被。I型胶原成束状大量分布，具有强大的抗张能力。Ⅲ型胶原成网格样分布，可保持组织器官形态结构。到目前为止， I、Ⅲ型胶原成为韧带组织胶原研究的重点。成纤维细胞是圆韧带的主要细胞成分，具有强大的胶原分泌功能。由于胶原分子在细胞内合成后要转运至细胞外组装成胶原纤维，因此在功能旺盛的成纤维细胞周围会出现环绕的胶原分子。这些细胞占全体成纤维细胞的比例就反映出纤维层I型胶原的合成能力。既往DDH关节囊免疫组化研究中发现有阳性表现的成纤维细胞数与年龄呈负相关，即年龄越小百分比越大，合成能力越强，随着年龄增大，合成能力降低［6］。本研究RT-PCR的结果显示DDH组圆韧带的成纤维细胞I型胶原mRNA表达量亦降低，表明DDH组圆韧带成纤维细胞在I型胶原转录水平的降低。目前为止关于DDH圆韧带中胶原mRNA水平的变化未见相关报道。
关节过度活动系由关节囊及韧带松弛而来，有许多学者推测它很可能与某些细胞外基质成分有关，如胶原、弹力纤维等［1］。Rodeo等［7］对肩关节的不稳定患者的肩关节囊的胶原和弹力纤维进行了如下研究：（1）定量分析稳定的还原胶原交叉键；（2）氨基酸分析；（3）测量胶原纤维的直径和强度；（4）免疫组化定量弹性蛋白和原纤维。验证了肩关节不稳定的病人的肩关节囊和皮肤的细胞外基质的生物化学和形态学改变的假设。本研究采用Western蛋白定量的方法，对关节囊I、Ⅲ型胶原进行研究，发现在DDH组关节囊中I型胶原较正常组减少，而Ⅲ型胶原与正常组无明显差异，并与mRNA表达趋势基本一致。I型胶原主要的生理功能为抵抗生物张力［2］，它的含量减少可能会导致抗张能力下降，关节松弛乃至脱位的发生。
综上所述，DDH患儿圆韧带中I型胶原在mRNA水平及蛋白水平表达的下降可能是导致关节松弛、进而脱位的主要原因。分析其原因可能有：(1)激素影响：体内实验中早在1976年Hama等发现卵巢切除大鼠髋关节囊的胶原含量及直径明显增加，应用雌激素后再明显减小，说明了雌激素对胶原合成的抑制作用。出生后虽然雌激素水平明显降低，但靶器官的高敏感性亦会使其受到激素影响，膝关节前交叉韧带中已被证实雌激素受体的存在［8］，同时交叉韧带内成纤维细胞的体外培养也证实培养液雌激素浓度与成纤维细胞增殖和I型前胶原合成量成反比，而对Ⅲ型前胶原合成无明显影响［9］。圆韧带的成纤维细胞内是否存在雌激素受体，胎儿在宫内高雌激素环境下胶原代谢是否受到上述影响目前未见相关报道，值得进一步探索。(2)合成与分解：细胞因子TGF-β和(或)IGF家族成员会促进成纤维细胞I型胶原的合成。金属蛋白酶(MMP)直接参与胶原的降解。另外一些小分子蛋白多糖(biglycan,decorin，fibrulin等)也对胶原合成及粘集起重要作用［10］。目前尚不知上述物质在DDH中对圆韧带胶原代谢的影响。(3)异常生物力学的影响：宫内拥挤，臀先露胎位，髋关节脱位后的负重行走等都会对圆韧带产生异常生物力学刺激，并可能由此转化为生物化学信号而影响胶原代谢。本研究尚不能区分胶原代谢异常与DDH的髋关节异常生物力学孰为因果，有待于进一步深入研究。
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作者单位：中国医科大学附属盛京医院小儿外科，沈阳 110004