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【摘要】 ［目的］ 探讨AIS患者椎体生长板凸、凹侧组织学及软骨细胞增殖与凋亡差异在AIS发生、发展中的作用。［方法］ 本研究中取AIS患者椎体生长板，应用HE染色评估生长板凸、凹侧的组织学分级差异，应用免疫组织化学方法及TUNEL方法评估生长板凸、凹侧软骨细胞增殖与凋亡指数，并对其进行比较。［结果］光镜下椎体生长板凸侧可见正常分层结构，生长板凹侧分层结构排列混乱。顶椎椎体生长板凸、凹侧组织学分级差异有统计学意义（<0.05）。终椎凹侧生长板和顶椎凹侧生长板组织学分级有明显差异且有统计学意义（P<0.05）。顶椎生长板凸侧软骨细胞增殖指数和凋亡指数明显高于凹侧，其差异有统计学意义（P<0.05）。在上终椎椎体生长板凸、凹侧软骨细胞PCNA增殖指数有明显差异且有统计学意义(P<0.05)。上、下终椎椎体生长板和顶椎椎体生长板凹侧软骨细胞增殖和凋亡指数有差异且有统计学意义(P<0.05)。在上、下终椎和顶椎椎体生长板凸侧软骨细胞TUNEL凋亡指数有差异且有统计学意义(P<0.05)。［结论］AIS患者上、下终椎和顶椎椎体生长板凸、凹侧组织学分级的差异和软骨细胞的增殖与凋亡指数差异可能表明椎体生长板凸、凹侧存在生长动力学差异，这可能影响侧凸的进展。
【关键词】 特发性脊柱侧凸； 组织学分级； 软骨细胞； 增殖； 凋亡
Histomorphological study of the spinal growth plates from the convex side and the concave side in adolescent idiopathic scoliosis∥WANG Shou-feng, QIU Yong, WANG Bin,et al.Department of Spinal Surgery, the Affiliated Drum Tower Hospital of Medical College of, Nanjing University, Nanjing 210008, China
Abstract: ［Objective］To investigate the difference of histological grades and chondrocytic proliferation and apoptosis between convex and concave sides in vertebral growth plates of AIS patients and its role in the development and progression of scoliosis. ［Method］In the present study, the growth plates from the convex and concave side of the vertebrae were characterized by the method of histology and immunohistochemistry to evaluate the growth activity, cell proliferation and apoptosis.［Result］Normal zoned architectures were observed in the convex side of the growth plate and disorganized architectures in the concave side. The histological grades were significantly different between the convex and the concave side of the growth plate in the apex vertebrae (P<0.05).The histological difference was also found significant statistically between end vertebrae and apex vertebrae in the concave side of vertebral growth plates (P<0.05). The proliferative potential indexes and apoptosis indexes of chondrocytes in the proliferative and hypertrophic zone in the convex side were significantly higher than that in the concave side in the apex vertebral growth plate(P<0.05). There was a significant difference of the proliferative potential index(proliferating cell nuclear antigen, PCNA index) between convex side and concave side at the upper end vertebra(P<0.05). The difference of the proliferative potential index and apoptosis index were found significant statistically in the concave side of the vertebral growth plate between end vertebrae and apex vertebrae(P<0.05). The same result was also found for the apoptosis index(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate biotin nick end labeling assay, TUNEL index) in the convex side of vertebral growth plate between end vertebrae and apex vertebrae(P<0.05).［Conclusion］The difference in histological grades and cellular activity between the convex and concave side may indicate that the bilateral sides of vertebral growth plate in AIS patients have different growth kinetics which may affect the curve progression.
Key words：idiopathic scoliosis； histological grades； chondrocyte； proliferation； apoptosis
青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis, AIS)是复杂的脊柱三维畸形。由于特发性脊柱侧凸的发生和进展通常出现于青少年快速生长期，椎体的非对称性生长被认为是这种疾病的发病机制之一［1］。椎体的生长主要来源于椎体生长板，作用类似于长骨的骨骺。在生长期间，生长板内的软骨细胞受制于局部生长因子和全身激素的调节，从而保证生长板内软骨细胞增殖与凋亡的平衡［2］。文献报告在生长期间，生长板内软骨细胞的活性是衡量生长率的指标［3］。 然而，对于AIS患者椎体凸、凹侧生长板生长活性及凸、凹侧生长板内软骨细胞的增殖与凋亡的差异未见报道。本文对AIS患者椎体凸、凹侧生长板的组织学分级及软骨细胞的增殖与凋亡指数进行比较研究，从而探讨椎体凸、凹侧生长板组织学改变在椎体楔变中作用及其在侧凸进展中的可能作用。
1 材料与方法：
1.1 临床资料与标本采集
2004年9月～2006年4月，收集本院行前路松解手术或前路固定融合手术的21例AIS患者椎体生长板126枚。病人年龄11～18岁，平均13.5岁。Cobb’s角为43～117°，平均65.1° 。其中Lenke 1A 3例，Lenke 1B 5例，Lenke 1C 7例，Lenke 5C 4例，Lenke 6C 2例。生长板取自顶椎、上终椎及下终椎，然后按凸、凹侧分成2组。所有标本收集后经固定、脱钙、标本石蜡包埋、切片，然后进行HE(hematoxylin & eosin)染色，免疫组织化学染色和TUNEL染色。
1.2 HE染色
取石蜡切片于二甲苯中脱蜡、酒精梯度水化、HE染色、脱水、透明和封片，观察光镜下椎体生长板和下关节突软骨结构改变。组织学分级：依据Noordeen等［4］对椎体生长板组织学分级为：0级、1级、2级、3级。（见图1）。
1.3 免疫组织化学染色
每份标本取4张切片，常规切片脱蜡，抗原修复，灭活，滴加正常山羊血清封闭液，至37℃，10 min后弃去多余液体。滴加抗细胞增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA ) (1∶80)鼠抗人单克隆抗体(克隆号PC10，Dako，丹麦)和抗聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)兔抗人抗体（labvision,USA），4℃过夜，漂洗3次。滴加二抗，37℃ 15 min，漂洗4次。DAB显色，镜下控制。苏木素衬染，封片观察。同时设置阴性对照。根据染色程度将阳性细胞分为三级:弱阳性(+) ;阳性(++) ;强阳性(+++)。统计时以强阳性表达的细胞为有增殖能力或凋亡细胞。光镜下根据染色深度将PCNA阳性细胞分为S期和非S期。由于S期阳性细胞更能反应细胞增殖状况，本实验仅统计S期阳性细胞。与PCNA阳性细胞类似，PARP阳性细胞也见于静止和增殖肥大层。光镜下测量软骨细胞PCNA指数和PARP指数。具体如下:×40倍镜下每个视野数100个细胞共数10个视野，计数其中阳性细胞数目，换算成PCNA指数和PARP指数(阳性细胞数/1000×100)。
1.4 TUNEL染色
观察软骨细胞凋亡，用TUNEL原位末端标记检测试剂盒(roche, mannheim, germany)，按其操作说明进行实验，其余步骤同“1.3”。
1.5 统计学处理
计量资料以算术平均数±标准差表示。应用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。椎体生长板凸、凹侧PCNA指数、PARP指数和TUNEL指数比较应用t检验。上下终椎与顶椎生长板的PCNA指数、PARP指数和TUNEL指数应用单因素方差分析。组织学分级比较应用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 组织学分级
组织切片HE染色后，光镜下观察椎体凸、凹侧生长板结构，包括静止层、增殖层、肥大层和钙化层。椎体生长板凹侧静止层、增殖层和肥大层高度相对于凸侧明显下降，且排列不规则，细胞丛集，分层不明显，有些区域增殖层和肥大层分界不清。
在顶椎区，椎体凸侧生长板的组织学分级明显高于凹侧生长板(P<0.05)。椎体凹侧生长板的组织学分级在顶椎与端椎椎体生长板之间也有明显区别(P<0.05)(见表1)。 表1 AIS患者椎体生长板凸、凹侧组织学分级比较部位
2.2 增殖指数与凋亡指数
在上、下端椎及顶椎椎体凸、凹侧生长板静止层内软骨细胞的增殖指数与凋亡指数差异没有统计学意义(P>0.05)。由于部分椎体凹侧生长板的增殖层与肥大层没有明确的分界，将增殖层与肥大层作为一层进行计算。在上终椎和顶椎凸侧生长板，其PCNA指数均高于相同区域的椎体凹侧生长板软骨细胞的增殖指数(P<0.05)。顶椎椎体凹侧生长板增殖-肥大层软骨细胞的增殖指数低于上、下终椎椎体凹侧生长板增殖-肥大层软骨细胞增殖指数(P<0.05) (见表2和图2)。 顶椎椎体凸侧生长板增殖-肥大层软骨细胞凋亡指数为41.23%，高于凹侧生长板凋亡指数26.13% (P<0.05)。上、下终椎椎体凸侧生长板增殖-肥大层软骨细胞凋亡指数低于顶椎椎体凸侧生长板凋亡指数(P<0.05)。然而，与其相反的是，上、下终椎椎体凹侧生长板增殖-肥大层软骨细胞的凋亡指数却高于顶椎椎体凹侧生长板增殖-肥大层软骨细胞的凋亡指数(P<0.05) (见表3和图3)。顶椎椎体生长板增殖-肥大层软骨细胞凋亡指数高于凹侧生长板凋亡指数(P<0.05)。上、下终椎椎体凹侧生长板增殖-肥大层软骨细胞凋亡指数高于顶椎椎体凹侧生长板凋亡指数(P<0.05) (见表4和图4)。表2 AIS患者椎体凸、凹侧软骨细胞增殖指数(PCNA指数)表3 AIS患者椎体生长板凸、凹侧软骨细胞增殖指数注: *代表凸、凹侧差异有统计学意义(P<0.05);#代表上终椎与顶椎差异有统计学意义(P<0.05);+代表下终椎与顶椎间差异有统计学意义(P<0.05) 表4 AIS患者椎体生长板凸、凹侧软骨细胞增殖指数+注: *代表凸、凹侧差异有统计学意义(P<0.05);#代表上终椎与顶椎差异有统计学意义(P<0.05);+代表下终椎与顶椎间差异有统计学意义(P<0.05)
3 讨论
脊柱左右两侧不平衡性生长导致脊柱的不对称已在文献中阐述［5］。这种非对称性生长可能导致畸形的进展。这些学者研究发现软骨生成下降、生长板内柱状结构排列紊乱、椎体生长板早期的生长停滞。McCarroll 和Costen等［6］ 在对特发性脊柱侧凸患者行单侧骨骺阻滞手术时采取的椎体凸侧生长板进行组织学观察发现软骨组织紊乱及软骨生长迟缓。
本研究中，AIS患者椎体生长板增殖层与肥大层软骨细胞致密，丛集，与正常长骨生长板明显不同。在上、下端椎及顶椎椎体凸、凹侧生长板，组织学分级存在明显差异。这种生长板软骨组织学分级的差异可能影响椎体骨的生长及在冠状面上椎体两侧生长速率，从而导致椎体楔形变，在AIS的进展发挥重要作用。
长骨或椎体骨的生长来源于生长板软骨细胞的增殖和在生长方向的肥大及其合成的最终骨化的基质。Wilsman等［7］ 对28天Long-Evans大鼠4个不同部位长骨生长板进行研究发现不同部位生长板每天产生的新的软骨细胞数量不同，新生的软骨细胞数量与长骨的生长速率呈正相关。但是这些研究均来自于动物模型，侧凸患者椎体生长板软骨细胞的增殖和凋亡的研究很少报道。本研究发现顶椎椎体凸侧生长板增殖-肥大层的软骨细胞增殖指数高于凹侧，这说明在AIS患者顶椎椎体凸、凹侧生长板可能存在软骨细胞增殖活性的差异。软骨细胞的凋亡也有相似的发现。大多数凋亡的软骨细胞出现在肥大层和矿化层。然而，除软骨细胞的PCNA指数在上终椎椎体凸、凹侧生长板有差异外，其余各增殖和凋亡指数在终椎椎体凸、凹侧生长板其差异并没有统计学意义。这些发现表明青少年特发性脊柱侧凸患者椎体生长板可能受应力的影响并遵循Hueter-Volkmann定律。必须强调的是，本研究中所取的AIS患者椎体生长板组织来源于椎体的凸侧和凹侧，凸侧承受张力，而凹侧更多承受压力。椎体凸、凹侧生长板软骨细胞的增殖和凋亡指数的差异可能是不同力学条件影响的结果。在长骨的纵向生长和软骨内成骨的过程中，软骨细胞的增殖和凋亡必须有机协调，才能保证正常的骨的生长［3］。在研究中，椎体凸、凹侧生长板软骨细胞的差异性的增殖和凋亡指数表明在椎体凸、凹侧生长板可能存在不同的细胞动力学，这引起椎体凸、凹侧不同的生长速率，进而导致凸、凹侧生长的不平衡及椎体楔形变。这些发现可能是不同的力学环境下的继发性表现，但是其可能在侧凸的进展中发挥重要作用。 图1aHG为0级，没有软骨增殖层，没有生长活性 图1bHG为Ⅰ级，散在软骨增殖区，没有生长活性 图1cHG为Ⅱ级，散在软骨增殖区，没有生长活性 图1dHG为Ⅲ级，生长板全层均有软骨增殖区，明显的生长活性
图2AIS患者光镜下顶椎生长板静止层凸、凹侧PCNV阳性细胞 图2a、b增殖肥大层凸、凹侧PCNA阳性细胞 图2c、d放大倍数：400× 图3AIS患者光镜下顶椎生长板静止层凸、凹侧TUNEL阳性细胞 图3a、b增殖-肥大层凸、凹侧TUNEL阳性细胞 图3c、d放大倍数：400× 图4AIS患者光镜下顶椎生长板静止层凸、凹侧PARP阳性细胞 图4a、b增殖-肥大层凸、凹侧PARP阳性细胞
图4c、d放大倍数：400× 尽管AIS患者椎体冠状面的楔形变是侧凸的原因或继发性改变目前还不清楚，但是椎体左右侧差异性的生长导致椎体生长不平衡很可能影响侧凸的进展［8］。本研究可能为椎体凸、凹侧生长不平衡提供一些组织细胞学的依据，但是椎体的生长是一个复杂的过程，与长骨的生长一样，椎体的软骨内成骨性生长受局部调节因子及系统调节因子的调节［9］。进一步研究应集中于基质的合成和局部及系统调节因子，进而探讨导致这些差异的内在机制。
【参考文献】
［1］ 王渭君,邱勇.青少年特发性脊柱侧凸发病机制研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2005,13: 380-382.
［2］ Provot S, Schipani E. Molecular mechanisms of endochondral bone development［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，328: 658-665.
［3］ Zhu F, Qiu Y, Yeung HY, et al. Histomorphometric study of the spinal growth plates in idiopathic scoliosis and congenital scoliosis［J］.Pediatr Int，2006, 48:591-598.
［4］ Noordeen MHH, Haddad FS, Edgar MA, et al. Spinal growth and a histological evaluation of the Risser Grade in idiopathic scoliosis［J］.Spine，1999，24: 535-538.
［5］ Roaf R. The basic anatomy of scoliosis［J］.J Bone Joint Surg Br，1966，48:786-792.
［6］ McCarroll HR, Costen W. Attempted treatment of scoliosis by unilateral vertebral epiphyseal arrest［J］.J Bone Joint Surg Am， 1960，42: 965-978.
［7］ Wilsman NJ, Farnum CE, Leiferamn EM, et al. Differential growth by growth plates as a function of multiple parameters of chondrocytic kinetics［J］.J Orthop Res，1996，14: 927-936.
［8］ Frank P, Castro Jr. Adolescent idiopathic scoliosis, bracing, and the Hueter-Volkmann principle［J］.The Spine Journal，2003, 3:180-185.
［9］ Guo X, Chau WW, Chen JCY, et al. Relative anterior spinal overgrowth in adolescent idiopathic scoliosis-result of disproportionate endochondral-membranous bone growth? Summary of an electronic focus group debate of the IBSE［J］.Eur Spine J, 2005, 14: 862-873.
作者单位：（南京大学医学院附属鼓楼医院脊柱外科，南京 210008）