蛋白质组学在骨关节疾病研究中的应用

【关键词】  蛋白质

    蛋白质作为细胞中的活性大分子，其表达水平的改变与疾病、药物作用或毒素作用直接相关。蛋白质组学的理论和技术的发展与完善使人们从组织或细胞的蛋白质整体水平去认识疾病成为可能。这一技术将是发现疾病标志物、鉴定和评价药物靶蛋白等十分有用的工具。

    1  蛋白质组学的概念及研究意义

    蛋白质组(Proteome)与蛋白质组学(Proteomics)的提出至今已有10年左右的时间。蛋白质组一词，源于蛋白质(protein)与基因组(genome)两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组是一个动态的概念，在同一个机体的不同组织和细胞中不相同，在同一机体的不同发育阶段，不同的生理状态下，乃至不同的外界环境下也不相同。各种复杂的生命活动，都是特定蛋白质群体在不同时间和空间不同组合的结果。

    蛋白质组学则是大规模、系统地在蛋白质组整体水平进行研究的一门新兴学科［1］，包括研究细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和翻译后修饰状态、蛋白质之间的相互作用和联系。蛋白质组学可分为比较蛋白质组学和表达蛋白质组学［2］。前者通过比较分析不同生理、病理条件下细胞、组织或体液中表达的蛋白质异同，筛选出许多具有临床标志意义的蛋白质关键分子。后者目的在于建立蛋白质表达谱和修饰谱的数据库、细胞定位图、蛋白质作用连锁图，探索和阐明生命现象的本质。将蛋白质组表达信息与基因组信息有效结合，这既可显示蛋白质翻译后加工修饰方式，又可克服分离蛋白质与理论蛋白质不一致的局限，从而使病理生理机制的解释更为完全和准确。

    2  骨关节疾病的蛋白质组学研究

    各类骨关节疾病，包括退行性关节炎、滑囊炎、滑膜炎、肩周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、股骨头坏死等，都是较难治愈的慢性疾患，患病后关节肿、痛、积液、僵直、增生、骨刺，活动艰难甚至导致残疾!蛋白质组学的发展将极大的促进骨关节疾病的研究，虽然目前还处于起步阶段，但从基因组向蛋白质组方向转变不失为今后骨关节疾病研究的一种新模式。

    2.1  骨细胞水平的蛋白质组研究  间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化能力的干细胞，为骨组织的修复与替代提供了一个崭新的领域，但有关MSCs定向分化的分子机制尚不清楚。Seshi［3］应用荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis，DIGE)对正常与白血病患者的骨髓间充质干细胞进行研究，在pH 4.6～7.0范围内检测出约5000个蛋白质斑点，随后应用基质辅助激光解析电离串联质谱(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS／MS)鉴定出128个差异蛋白，其中72个差异蛋白在白血病患者的骨髓间充质干细胞中表达增高或降低1.25倍以上。Foster等［4］运用MS方法比较得出人MSCs定向成骨细胞分化前、后的463个蛋白，包括已知的人MSCs细胞表面抗原(CD71、CDl05、CDl66等)，膜相关蛋白，细胞黏附分子和受体等。其中成骨细胞分化前有83个蛋白表达增高2倍以上，有21个蛋白表达下降2倍以上。刘元林等［5］采用定向成骨分化诱导培养体系诱导MSCs定向成骨细胞分化，对未分化与分化后的MSCs细胞总蛋白进行提取，经双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)找到38个蛋白差异点，基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鉴定出23个差异蛋白分子表达。Zhang等［6］经一系列培养诱导hMSC分化为成骨细胞，在前3～7 d hMSC与成骨细胞的蛋白表谱类似，运用2-DE检测出102个表达改变2倍以上的蛋白斑点，MALDI-TOF-MS鉴定出52个差异表达蛋白。涉及新陈代谢、信号转换、核酸复制、钙结合蛋白、蛋白折叠等。这一研究为阐明成骨细胞分化的整个蛋白表达情况提供了很好的基础。可见，蛋白质组学方法可用于高通量筛选、研究MSCs定向分化过程中细胞内可能具有调控作用的重要蛋白分子。另有研究者［7］对滑膜细胞进行原代培养，鉴定滑膜细胞类型后提取蛋白进行2-DE分离，比较类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)与骨关节炎(osteoarthritis，OA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异。结果显示FLS蛋白酪氨酸磷酸化在RA较OA明显增多，其中以相对分子质量42×103～95×103间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，两者具有非常显著性差异。Dasuri等［8］也对RA患者滑膜液中的FLS进行研究，通过2-DE和MS已识别鉴定出254种蛋白质。Dotzlaw等［9］通过比较健康人和RA患者的外周血单核细胞的蛋白质2-DE图谱发现，18种蛋白质在RA患者中表达高于健康人2倍或更多。同时发现11种蛋白质在健康人(对照组)中表达高于RA患者2倍或更多。这些表达不同的蛋白质经MALDI-TOF-MS法鉴定，其中有一些过去已被显示在RA的发病机制有潜在的作用，因而认为这样的蛋白质表达图谱的比较可能具有诊断学价值。Catterall［10］发现软骨细胞分泌的蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)和葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)对2DE聚焦有明显的干扰，在运用不同方法去除GAG影响后，行2DE并结合电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry，  ESI-MS)，对IL-1和制瘤素M刺激软骨细胞分泌蛋白的改变进行研究，鉴定出8个有意义的蛋白。该研究者认为蛋白质组学方法为研究软骨细胞分泌蛋白提供了更有价值的蛋白质加工相关信息。

    2.2  血清和骨关节液的蛋白质组研究  血液样本信息含量十分丰富，标本易于采集，是蛋白组学主要的研究对象。因此，利用血液标本作骨关节相关疾病的研究较多。Xiang等［11］对OA和RA血清蛋白质组进行比较，找到19个差异蛋白质，其中一个被鉴定为磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase，TPl)，认为对TPI的自身抗体有可能被用作为OA的诊断标志物。Tan等［12］应用2-DE结合MALDI-TOFMS分析方法，对股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)和正常人血清蛋白质组学进行了比较，找到7个差异表达蛋白质，然后进一步应用酶联免疫技术测定6个差异蛋白在ONFH，OA、RA和骨折病人血清中的表达，结果发现有4个差异蛋白在ONFH与其他3种病例中的表达有区别。Saulot等［13］应用2-DE和MS及免疫印迹方法(其所用抗原为重组蛋白)研究255例患有早期关节炎的患者(145例RA患者、70例非RA风湿性疾病患者和40例未定性关节炎患者)的血清，发现抗11-烯醇化酶的自身抗体存在于早期RA患者的血清，此抗体对RA可能具有诊断和预后价值。对于关节软骨损伤性疾病，由于任何软骨源性标志物分子在血清中的浓度不可能客观地反映某个指定关节软骨损伤的改变，因此关节软骨标志物血清浓度与特定关节间存在严重的局限性，而检测指定关节滑液将可能解决这一问题。Sinz等［14］应用2-DE和MS研究RA、反应性关节炎和OA患者的血浆及滑膜液的蛋白质表达情况，结果显示钙粒蛋白B仅在RA患者的滑膜液中表达，血清淀粉样A蛋白在RA患者的滑膜液和血浆中均可检测到，但在OA患者中未检测到。Robinson等［15］用蛋白质芯片技术比较RA和OA患者的滑膜液蛋白质图谱，发现许多可用于鉴别诊断的候选生物标志物，其中，相对分子质量为10 850的蛋白质峰是RA中表达比较明显的标志物。Drynaa等［16］应用2-DE结合MS分析方法分析和鉴定了RA患者和OA患者的血浆及滑膜液的蛋白质，结果是钙结合蛋白A9(S100Ag)被鉴定为滑膜液中明显的标志蛋白。随后通过应用酶联免疫技术测定了RA、OA及其他炎症性关节疾病患者的血浆和滑膜液中钙结合蛋白A8／A9(S100A8／A9)杂络物的水平，结果发现S100A8／A9杂络物的血浆水平和滑膜液中的水平相关性很好。因此，测定血浆中的S100A8／A9杂络物可以用来区分RA患者与其他炎症性关节病患者(包括OA患者及正常对照组)。杨波等［17］建立了正常组、牛II型胶原与完全弗氏佐剂诱导的胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型组大鼠关节滑膜的的2DE图谱，平均点数为(10 204±40)个蛋白质点。应用MALDI-TOF-MS鉴定两组滑膜差异表达大于2倍的蛋白质点35个。这些差异表达蛋白质的功能涉及物质代谢、能量产生、物质转运、抗氧化、信号转导及细胞骨架蛋白，它们可能以不同的方式参与了病变过程，为揭示CIA滑膜病变的机制及RA的发病机制提供了新的线索。而且用蛋白免疫印迹法(western blotting)进行膜联蛋白I(annexin l)、醛缩酶A(aldolase A)的表达验证与2-DE结果一致，表明Annexin l aldolase A可能与CIA的关节滑膜病变有关。

    血液标本易获取，但其中蛋白质组成成分异常复杂，并且高、低丰度蛋白质含量的动态范围非常宽(可达到1010数量级)。在如此复杂的血液蛋白质组中，必须采用合理步骤尽量去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白质，这样才可以实现富集低丰度蛋白质，发现低丰度蛋白质中的候选标志物。骨关节液体如滑液，其标志物分子比血清标志物更能客观地反映所检测关节的病变情况，但是滑液难获取且浓度也受诸多因素的影响，如改变同时出现在炎症或关节运动之后，故难以得到精确的数据。每种标本各有利弊，在临床实践中到底采取哪种方法进行相关研究应根据实际情况而定。

    2.3  骨组织水平的蛋白质组学研究  刘建仁等［18］建立大鼠激素性骨坏死模型，分别提取正常组、激素性骨坏死组和中药治疗组的大鼠股骨和肱骨组织的总蛋白，进行2-DE和MALDI-TOF-MS质谱分析，鉴定出3个差异蛋白，分别为阻凝蛋白重链ⅡB、磷脂谷胱甘肽过氧分酶及泛素化酶E2(MW：17 kd)，初步认为这三种蛋白质在激素性骨坏死的发病及中药治疗过程中发挥着重要调控作用。骨组织是一种比较特殊的生物标本，又是研究骨关节疾病必不可少的实验材料，因此，骨组织蛋白提取方法的优化对于骨组织蛋白质组学研究具有重要意义。Jiang［19］等首先将狗颅骨组织用盐酸溶液溶解，然后通过3种不同提取液提取蛋白，将盐酸溶液与提取液中的蛋白收集起来行二维液相色谱串联质谱(two-dimensional，high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS／MS)，鉴定出2 479个蛋白质点，其中包括40种骨特有蛋白和15种潜在的蛋白生物标志物。这一方法大大提高了骨组织蛋白的提取效率。然而目前以骨组织为样本进行蛋白质组学研究的相关报道仍较少，而对于软骨组织的研究则相对较多。Hermgansson等［20］对12个OA患者不同关节(膝、髋、肩)和14个非OA者的软骨组织进行培养，在对软骨细胞分泌的PGs运用沉淀法去除后进行2-DE，50～100个结合了放射性标记物的蛋白点被检测，MS鉴定出的19个差异蛋白。其中H型胶原复合物在OA软骨组织中表达明显上调，相对于婴儿和青少年，成人非OA软骨组织中该蛋白几乎无表达。研究者认为H型胶原复合物在成熟骨骼中表达下调，而当发生骨关节炎时将被再活化起到修复软骨的作用。Frederic等［21］将3名关节置换者捐献的新鲜软骨组织，经过切割、绞碎后用无血清培养基培养，48 h后收集培养物进行2-DE和串联质谱，鉴定出43个蛋白，部分是已有报道的软骨细胞分泌蛋白，如YKL-39、骨保护素等；部分未在软骨细胞相关研究中报道，如血清淀粉样P物质，维生素D结合蛋白，血小板生成素，纤维蛋白素原，血管生成因子，肌动蛋白等。该研究者认为对于系统研究人骨关节炎软骨分泌或释放的蛋白，寻找到新的诊断标记物，蛋白质组学方法无疑提供了一种有力工具。软骨组织中丰富的PGs和胶原等细胞外基质，对2-DE聚焦和小分子蛋白的检测有影响。Vincourt等［22］利用基质的生物学特性改进传统方法进行软骨组织蛋白提取，实验过程中尽量保持基质的原始状态避免机械浸出，将软骨组织在低温(-30℃)切片机上切割成10 μm左右大小，同时在提取液中加入高浓度氯化钠(不超过500 mmol/L)，在胶原交联状态下促使软骨组织其他组分溶解，并且采用环丙基甲醇(cyclopropyl-carbinol，CPC)选择性沉降法去除PGs。但因CPC是离子型去垢剂，也会影响聚焦，因此最后用甲醇／氯仿在室温下沉淀纯化提取物中的CPC，同时也去除了核酸和脂质。在采用改进方法提取软骨组织蛋白后进行2-DE和银染，获得了600多个蛋白斑点，经MALDI-TOF-MS鉴定出127种不同功能蛋白质。由此可见，通过改进获得快速、有效、恰当的软骨及骨组织蛋白提取方法，将有利于骨组织蛋白质组学研究。

    3  结语

    蛋白质组学研究平台的建立为骨关节疾病的研究提供了一个新的契机。但由于病因不清、病程缓解与复发交替的动态变化过程和复杂的临床分型，给研究增加了难度。因此，该技术在这一领域的应用目前还处于比较肤浅的阶段，主要用于蛋白质组表达模式分析，真正涉及功能蛋白质组的研究还很少，与实际应用的差距则更远。相信在骨关节疾病专家与基础和应用基础科学家的共同努力下，蛋白质组学在骨关节疾病研究领域将有十分广阔的应用前景。可以预见，随着方法的不断改进与研究的不断深入，今后将能借助作为骨关节疾病诊断的一组或一群蛋白质标志物，来进行临床的协助诊断。

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作者单位：（广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，南宁 530021）