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【摘要】 ［目的］ 通过电镜研究软骨终板在椎间失稳环境下的退变过程，为椎间盘退变的治疗提供新的思路和方法。［方法］ 取48只6个月龄日本大耳白兔，雌雄不限，体重为（2.5±0.2） kg，随机进行分组，分为对照组和实验组，对照组为21只；实验组为27只；先将实验组兔腰背部皮毛剪除，用安定注射液1.25 mg/kg、氯胺酮0.02 g/kg、阿托品0.125 mg/kg顺次耳缘静脉注射麻醉后，俯卧固定于手术台上，用1%碘伏消毒手术区域，以髂嵴平对椎间隙（即L6、7）为中心，从正中取一长约4 cm纵行切口，切开皮肤及皮下组织，锐性分离，暴露棘突、椎板及上下关节突，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开，然后依次切除L6、7棘上及棘间韧带，咬除第6腰椎两侧下关节突，造成椎间失稳，用无菌生理盐水冲洗切口，依次缝合各层组织；术后动物在笼中自由活动。实验组分别在术后2个月、4个月、6个月取材，对照组在相同条件下饲养后2个月、4个月、6个月取材；对椎间盘软骨终板用透射电镜观察软骨终板的结构，以综合判断软骨终板的退变过程。［结果］椎间失稳可导致椎间软骨终板胶原纤维结构由整齐有序、排列紧密向杂乱无章、排列松散退变。［结论］椎间失稳能明显导致椎间软骨终板的退变。
【关键词】 椎间盘； 软骨终板； 椎间失稳； 退变
Degenerative process of the cartilage endplate due to the intervertebral destabilization-an experimental rabbit model research by eletron microscope∥ZHANG Zhao，HUO Hong-jun，YANG Xue-jun，et al.Department of Spine and Joint Surgery，The Chengde Centre Hospital , Hebei 067000，China
Abstract: ［Objective］To find out the new method to cure the intervertebral discs degeneration by way of the eletron microscope study of the degeneration of the cartilage endplate in the circumstances of the intervertebral destabilization. ［Method］To choose forty-eight white macrotia rabbits of Japan,which weighed within the range of 2.5±0.2 kg,female and male was unrestricted.These rabbits were divided into 2 groups randomly,with 21 rabbits in the contrast troup,with 27 rabbits in the experimental group.First 27 rabbits of the experimental group were destabilizated by operated on L6、7.Inj Diazepam 0.25 mg/kg,Inj Ketamine 0.02 g/kg and Inj Atropine 0.125 mg/kg was one by one injected into the rabbit through the auris vein,shearing the rabbit hair of backside waist,fixing the rabbit on operation table in face lying,using 1% Povidone Ioding to degerm the operation area.Every rabbit was incised at the backside of its waist,that incisal opening is located in the center of the intervertebral space (L6、7 space) that both side iliac crest line correspond ,from the meso-ordinate direction cut about 4 cm incision,cutting open skin and subcutaneous tissue,thoroughly ,exposing the spinous processes the vertebral plates and the upper-inferior articular processes,entirely segregating the muscles that cohere the spinous processes the vertebral plates and the articluar process,then excising the supraspinal ligaments and interspinal ligaments,biting off two sides the inferior articular processes of L6,in order that resulting in intervertebral destabilization,using 0.9% Inj.Sodium Chloride to washout the incisal opening,in order sewing up each layer tissues.After operation rabbits can freely move in the cages.To draw the materials from all groups after two months,four months and six months orderly.Using transmission electron microscope to observe the structure the cartilage endplate,the author should judge the degenerative course and mechanism of the cartilage endplate synthetically.［Result］The intervertebral destabilization can cause the collagen fibers degenerates from the regular and compact structure to the disorder and loose structure.［Conclusion］The intervertebral destabilization can distinctly lead to the degeneration of the cartilage endplate.
Key words：intervertebral disc； cartilage endplate； the intervertebral destabilization; degeneration
根据骨性关节炎的临床和实验研究，关节的稳定性在骨软骨退变及损害中发挥着非常重要的作用，因此，从理论上可以推测，椎间失稳软骨终板的退变过程，类似于关节失稳后关节软骨的退变过程。认识软骨终板退变与椎间盘退变之间的相互关系及其发生机理是正确处理阻止和延缓椎间盘退变的关键。本实验就单独一人为手术咬除兔L6腰椎两侧下关节突，改变腰椎内部结构造成椎间失稳，用电镜来观察椎间软骨终板的退变过程，着重考虑椎间失稳对软骨终板的退变影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
取48只6个月龄日本大耳白兔(由内蒙古农业大学动物实验中心提供),雌雄不限，体重为（2.5±0.2）kg，均在相同条件下饲养。随机进行分组，分为对照组和实验组，对照组为18+3只兔；实验组为24＋3只兔（注：加号后的数为备用兔数，以下同）。先将实验组24+3只日本大耳白兔,将其腰背部皮毛剪除，用安定注射液1.25 mg/kg、氯胺酮 0.02 g/kg、阿托品0.125 mg/kg顺次耳缘静脉注射麻醉后,俯卧固定于手术台上,用1%碘伏消毒手术区域，铺无菌手术巾，取髂嵴平对椎间隙（即L6、7）为中心（用X线机确定）,从正中取一常约4 cm纵行切口,切开皮肤及皮下组织,锐性分离,暴露棘突、椎板及上下关节突，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开,然后依次切除L6、7棘上及棘间韧带,咬除L6椎体两侧下关节突，造成椎间失稳，用无菌生理盐水冲洗切口,依次缝合各层组织。术后兔在笼中自由活动。实验组分别在术后2个月、4个月、6个月取材，对照组在相同条件下饲养后2个月、4个月、6个月取材。对椎间盘软骨终板用透射电镜观察软骨终板的结构,以综合判断软骨终板的退变过程。
1.2 试剂和设备
1.2.1 试剂：①北京格林莱特商贸发展有限公司格林莱特产 四氧化锇（osmium tetroxide）；②海德创业（北京）生物科技有限公司醋酸双氧铀（uranyl acetate）；③上海易微信息科技有限公司提供emicron生产的Epon 812包埋剂组件。
1.2.2 设备：①日本产日立H－700H透射电子显微镜;②瑞典产LKB- UltrotomeⅤ型超薄切片机;③博进:手提式X射线透视仪 BJI-1X型;④手术器械一套。
1.3 观察指标及方法
1.3.1 取材:将目标兔耳缘静脉注射20 ml空气栓塞处死,用骨刀快速切取完整L6、7椎间盘，取横截面为1 mm×1 mm左右包含软骨终板的组织放入3%戊二醛固定液中固定, 24 h后用15%EDTA溶液脱钙。
1.3.2 电镜超薄切片样本制备 脱钙后的技术流程为：将组织用自来水冲洗12 h→2.5%戊二醛固定24 h→0.2 mol/L磷酸缓冲液漂洗20 min（4℃冰箱内），共3次→（锇酸固定）1%四氧化锇固定1 h→0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗20 min，共3次→（脱水）100%乙醇15 min→（脱水）70%乙醇15 min→（脱水）90%乙醇15 min→（脱水）95%乙醇15 min→（脱水）100%乙醇（Ⅰ）10 min→（脱水）100%乙醇（Ⅱ）10 min→包埋剂Ⅰ浸透（包埋剂与无水乙醇1∶1混合）30 min→包埋剂Ⅱ浸透（包埋剂与无水乙醇2∶1混合）30 min→纯包埋剂浸透1 h→包埋→聚合：放在胶囊内渗透24 h（37℃），60℃聚合48 h→修块→超薄切片→醋酸双氧铀染色30 min→电镜观察分析。
1.3.3 观察指标 用透射电子显微镜从形态学上观察软骨终板胶原纤维排列、分布，软骨终板软骨细胞形态学变化。
2 实验结果
超微结构的变化：对照组在各实验时间点短期自然增龄过程中的软骨终板胶原纤维结构规整，排列有序紧密，软骨细胞的细胞核细胞膜清晰，细胞饱满，其变化无显著性差异（图1～2）。实验组在手术后各实验时间点的软骨终板胶原纤维逐渐由结构整齐紧密、排列有序逐渐向结构紊乱、排列无序而松散的方向发展，软骨细胞逐渐出现皱缩、胞浆致密、细胞器密集有不同程度的凋亡，整个软骨细胞的核染色质逐渐变致密近而变小固缩，其变化有显著性差异（图3～8）。
3 讨论
椎间盘除纤维环外层外本身无血管结构，其营养供应主要有软骨终板途径和纤维环途径，其中前者是主要的。软骨终板是位于椎间盘与椎体之间一层薄的透明软骨，它与椎体骨髓血窦直接接触，其营养物质转运主要通过血窦-软骨终板界面进行扩散(弥散) ［1］。胎儿时期有自椎体穿过软骨终板的血管供应髓核，在10岁左右此血管通道大部分闭锁，其后髓核的代谢在一定程度上取决于软骨终板的通透性［2］。临床观察以及实验研究均表明［3～5］，在椎间盘退变过程中，软骨终板可出现损伤、增厚、钙化或者骨化，软骨终板的增厚、钙化及其骨化将严重影响其弥散营养物质的能力，导致椎间盘营养的进一步障碍，而加重或加速椎间盘退变的发生，因此软骨终板在椎间盘的营养代谢方面发挥极其重要的作用。椎间盘软骨终板的变化过程是受多种因素变化影响的，这些因素包括生物体自身的内部因素和生物体所处环境的各种外部因素，因此每个生物在不同时期不同环境下软骨终板的变化过程是不同的［6］。为此本课题就人为造成椎间失稳导致椎间盘软骨终板的退变过程进行的一些相关的实验研究。兔与人类的椎体生长发育过程是基本相似的，都是通过椎体骺软骨不断钙化和骨化来增加椎体的高度。爬行动物与人类椎体的生物力学结构和应力方向是不同的。但其生长发育过程和退变过程是相似的，因此，对爬行动物的实验研究是有一定的比较意义的［7～9］。
在自然增龄的过程中，椎间盘的正常生物力学结构存在，因而软骨终板在各实验时间点的短期内，构成软骨终板的胶原纤维和软骨细胞结构无明显变化；但在长时间的自然增龄过程中，软骨终板也应该是退变的，这也符合生物体生长发育的自然发展规律［2］；如果此时椎间盘处于异常应力环境中，或椎间盘处于异常生化内环境中，其软骨终板的变化规律又是如何呢?均有待于进一步研究。
椎间失稳可在短期内使软骨终板的应力发生改变，导致椎间软骨终板胶原纤维排列松散紊乱及自身结构破坏，以及软骨细胞逐渐出现皱缩、胞浆致密、细胞器密集有不同程度的凋亡［1］，从而引起软骨终板的退变；软骨终板的退变可直接影响椎间盘髓核及纤维环的营养供给，使髓核及纤维环发生退变，髓核及纤维环的退变可引起椎间盘的退变和其生物力学结构的改变，进而引起软骨终板的营养代谢障碍及椎间失稳加重，加速软骨终板的退变，并形成恶性循环，导致椎间盘退变逐渐加重；椎间失稳是导致椎间软骨终板在短期内退变的主要原因，有效预防和阻止椎间失稳的发生，以及椎间失稳后的稳定性重建是临床工作中治疗颈肩痛和腰腿痛的首选方法。
本实验是在单独一人为手术造成兔L6、7椎间失稳，仅用电镜观察和研究椎间软骨终板退变的情况。由于条件所限，无法从多因素多方位多角度应用不同手段去研究和探索软骨终板退变机理，这就是本实验研究的不足。因此希望今后从多因素不同时空去研究椎间盘软骨终板的变化机制，从本质上揭示椎间盘及软骨终板的退变规律，为临床腰腿痛及颈肩痛的治疗提供理论依据。
【参考文献】
［1］ 黄宗强，刘尚礼，郑召民.椎间失稳诱发椎间盘退变的病理学观察［J］.中国矫形外科杂志，2007，15：376-379.
［2］ Bernick S, Caillel R.Vertebral end-plate changes with aging of human vertebrae［J］.Spine, 1982，7: 97-102.
［3］ 彭宝淦，贾连顺，施杞，等.软骨终板钙化在椎间盘退变过程中的作用机理［J］.中国矫形外科杂志，2000，7：147-150.
［4］ Unglaub F, Guehring T,et al.Controlled distraction as a therapeutic option in moderate degeneration of the intervertebral disc-an in vivo study in the rabbit-spine model［J］.Z Orthop Ihre Grenzgeb，2006，144:68-73.
［5］ Kim KW, LimTH, Kim JG,et al.The origin of chondrocytes in the nucleus pulposus and histologic findings associated with the transition of a notochordal nucleus pulposus to a fibrocartilaginous nucleus pulposus in intact rabbit intervertebral discs ［J］.Spine，2003，15:982-990.
［6］ 彭宝淦，贾连顺.椎间盘退变机理的研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2000，7：390-392.
［7］ Haschtmann D, Stoyanov JV, et al.Establishment of a novel intervertebral dlsc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system［J］.Spine，2006，31:2918-2925.
［8］ 彭宝淦，贾连顺，施杞，等.软骨终板钙化在椎间盘退变过程中的作用机理［J］.中国矫形外科杂志，2000，7：147-150.
［9］ Phillips FM, Reuben J, Wetzel FT. Intervertebral disc degeneration adjacent to a lumbar fusion.An experimental rabbit model ［J］. J Bone Joint Surg Br，2002，84:289-294.
作者单位：1.河北省承德市中心医院脊柱关节外科，承德 ; 2.内蒙古医学院第二附属医院脊柱外科，呼和浩特